一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1、构建及应用

摘要

本发明公开了一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1、构建及应用，pBD1质粒的构建，利用PCR、酶切、酶连、测序、转化等多种分子生物学手段，在芽孢杆菌表达载体pHY300p1k的基础上，构建了一个含有IPTG诱导型的Pgrac启动子、dCas9及sgRNA的质粒pHY300‑dCas9‑sgRNA(pBD1)，因为质粒的启动子强度大、有广泛的宿主范围，因而，理论上该质粒适用于广泛的芽孢杆菌。

主权项

一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1 Pveg‑SapI‑sgRNA模块的搭建设计引物Pveg‑F‑XbaI和Pveg‑R，以质粒psb1c3‑pveg‑RBS‑dCas9‑b0015为模板，扩增获得芽孢杆菌组成型表达的启动子Pveg；其中质粒psb1c3‑pveg‑RBS‑dCas9‑b0015的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，而引物Pveg‑F‑XbaI和Pveg‑R序列如下：Pveg‑F‑XbaI GCTCTAGAGGAGTTCTGAGAATTGGTATGPveg‑R      ACATTTATTGTACAACACGAGCC将两条引物sgRNA‑Sap I‑F和sgRNA‑Sap I‑R进行退火，获得长度为73bp的SapI box区域；sgRNA‑Sap I‑F和sgRNA‑Sap I‑R的序列如下：TGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTTGAAGAGCCATGTCAGGCTsgRNA‑SapI‑FCTTCTGACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAGAAGAGCCTGACATGGCTCsgRNA‑Sap I‑RTTCAACA将引物PsgRNA‑F和PsgRNA‑R‑HindIII也进行退火，获得3’端携带HindIII酶切位点的长度为82bp的sgRNA片段；PsgRNA‑F GTTTTAGAGCTAGAAATAGCPsgRNA‑R‑HindIII CCC AAGCTT AAAAAAGCACCGACTCGGTGC分别将以上的启动子Pveg、SapI box区域和sgRNA片段进行PCR，切胶回收，进行Slice产物PCR；最终获得长度为357nt的含启动子Pveg的sgRNA表达框最终序列，即Pveg‑SapI‑sgRNA模块；S2 pBD1质粒的构建分别将质粒pHY300‑Pgrac和步骤S1构建得到的Pveg‑SapI‑sgRNA模块用限制性内切酶HindIII和XbaI进行双酶切，回收，将两个回收产物用连接酶连接，获得质粒pHY300‑Pgrac‑SapI‑sgRNA；扩增dCas9，用Bg1II酶切，装入载体质粒pHY300‑Pgrac‑SapI‑sgRNA，并用酶切或PCR的方法验证基因插入方向的正确性，获得质粒pHY300‑dCas9‑sgRNA，即为芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1。