一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法

摘要

本发明涉及一种利用毛细管电泳技术筛选甲胎蛋白特异性核酸适配体的方法，包括以下步骤：设计并构建随机寡核苷酸文库，联合毛细管电泳技术与SELEX筛选方法，富集到能与甲胎蛋白结合的寡核苷酸，经克隆、测序、毛细管电泳分析以及免疫荧光验证，最终获得能与甲胎蛋白特异性结合的寡核苷酸，即适配体。本发明提供了一种高效、特异的适配体筛选方法。本发明的优点在于：依赖于毛细管电泳技术的优势，缩短了筛选时间，仅用4轮循环即可完成；同时减少了由基质作用引起的非特异性筛选。

主权项

一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括以下步骤：设计并构建大容量随机寡核苷酸文库以及用于PCR扩增的上游引物和下游引物，通过以毛细管电泳为基础的SELEX方法，富集能与甲胎蛋白结合的寡核苷酸，最终经克隆、测序以及验证后得到与甲胎蛋白特异性结合的寡核苷酸，即适配体；所述的随机寡核苷酸文库以及上、下游引物序列为：随机寡核苷酸文库的序列如SEQ ID NO.1所示，上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；所述的以毛细管电泳为基础的SELEX方法包括以下步骤：随机寡核苷酸文库与甲胎蛋白共同孵育，混合物进行毛细管电泳，收集与甲胎蛋白结合的寡核苷酸，常规PCR扩增，制备单链DNA文库，文库纯化后用于下一轮筛选；所述常规PCR条件为：94 ℃，3 min，94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，30 s，扩增10个循环，72 ℃，5 min；所述单链DNA文库制备方法包括以下步骤：在链霉亲和素偶联的磁珠中加入常规PCR扩增产物，常温孵育，通过双链DNA上的生物素与磁珠上的链霉亲和素的相互作用将双链DNA吸附到磁珠表面，洗涤磁珠后加入碱液，常温变性，含有单链DNA的上清液用弱酸中和，产物PAGE切胶纯化；所述的磁珠与PCR产物的孵育时间控制在20‑30 min，碱变性时间控制在5‑10 min。