一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法

摘要

本发明属于生物技术与生命科学技术领域，涉及一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法。该方法通过Sp-Tomato荧光报告载体的构建、Sp-Tomato荧光报告载体导入乳腺癌细胞系、荧光信号的检测、乳腺癌肿瘤干细胞的筛选和筛选细胞的干细胞活性鉴定等步骤来实现乳腺癌和其他肿瘤干细胞的筛选，为筛选乳腺癌干细胞，进行下游的干细胞生物学特征研究提供了有力的工具。

主权项

一种使用荧光报告系统筛选乳腺癌肿瘤干细胞的方法，其特征在于，实现该方法的步骤是：一、Sp‑Tomato荧光报告载体的构建：1)从人类基因组中调取SOX2启动子区域：针对SOX2启动子的序列涉及调取扩增引物为：FW:5’‑GGTACCGGCCAAAGAGCTGAGTTGGA‑3’RV:5’‑AAGCTTGAGGCAAACTGGAATCAGGATC‑3’以人乳腺癌细胞系MCF‑7的基因组DNA为模板，采用保真酶进行PCR扩增，得到SOX2启动子区域，连接到T载体经测序后确定无误；2)将SOX2启动子区域插入pGL‑3basic中，并检测虫荧光素酶活性：将SOX2启动子区域从T载体酶切后连入pGL‑3basic虫荧光素酶活性报告载体，并转入乳腺癌细胞系中检测其活性，虫荧光素酶活性直接反应SOX2启动子活性；3)将虫荧光素酶的开放阅读框替换为Tomato荧光蛋白的开放阅读框：将pGL‑3basic中的虫荧光素酶阅读框——Luciferase替换为荧光蛋白Tomato的阅读框，Tomato荧光蛋白的荧光信号强度直接反应SOX2启动子的活性；二、Sp‑Tomato荧光报告载体导入乳腺癌细胞系——MCF‑7，MDA‑MB‑231，T47D，采用细胞电转的方法将Sp‑Tomato荧光报告载体导入到不同的乳腺癌细胞系中；三、荧光信号的检测：电转24小时以后，可以在荧光显微镜下观察到不同细胞具有不同的信号强度，通过流式细胞仪分析可以得出细胞群体中的信号分布情况，阳性细胞的含量百分比等信息；四、乳腺癌肿瘤干细胞的筛选：根据荧光信号的分析结果，对比阴性组，在流式细胞仪中设置Tomato荧光蛋白信号的筛选门，从SOX2高表达细胞株MCF‑7中分选出SOX2启动子活性强的乳腺癌细胞；五、筛选细胞的干细胞活性鉴定:经过体外成球实验鉴定，筛选出来的SOX2启动子活性高的乳腺癌细胞在具有更强的成球能力，具有干细胞特征。