一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法

摘要

本发明公开了一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法，包括如下步骤：(1)根据目的选取基因，分别设计至少二miRNA/shRNA的基因序列和至少一sgRNA的基因序列；(2)将该至少二miRNA/shRNA的基因序列顺序排列，并将一sgRNA的基因序列连接于二miRNA/shRNA之间，形成一多顺反子；(3)将多顺反子置于RNA聚合酶启动子下游，并置于载体上导入具有miRNA的动物细胞或植物细胞中以转录形成pri-miRNA/shRNA-sgRNA；(4)上述pri-miRNA/shRNA-sgRNA在上述动物细胞或植物细胞中被RNase III加工成pre-miRNA/shRNA-sgRNA，在此过程中，sgRNA和pre-miRNA/shRNA分别释放出来。

主权项

一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据目的选取需要抑制其表达的基因以及需要进行编辑的基因，分别设计至少二miRNA/shRNA的基因序列和至少一sgRNA的基因序列；(2)将该至少二miRNA/shRNA的基因序列顺序排列，并将一sgRNA的基因序列连接于二miRNA/shRNA之间，形成一miRNA/shRNA‑based sgRNA多顺反子；(3)将miRNA/shRNA‑based sgRNA多顺反子置于RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子下游，并置于载体上导入具有miRNA的动物细胞或植物细胞中以转录形成pri‑miRNA/shRNA‑sgRNA；(4)上述pri‑miRNA/shRNA‑sgRNA在上述具有miRNA的动物细胞或植物细胞中被RNase III加工成pre‑miRNA/shRNA‑sgRNA，在此过程中，sgRNA和pre‑miRNA/shRNA分别释放出来，其中sgRNA被装配包裹入不同类型的Cas9蛋白中，露出Cas9蛋白的多余部分被RNA外切酶降解，形成sgRNA‑Cas9复合物，进而识别相应的靶位点，对所述需要进行编辑的基因进行编辑；pre‑miRNA/shRNA则被加工进入RISC复合物成为成熟的miRNA/shRNA，以抑制所述需要抑制器表达的基因的表达。