一种构建小麦花叶病毒侵染性克隆的方法及其应用

摘要

本发明涉及一种简单快速构建小麦花叶病毒全长cDNA侵染性克隆的方法，应用一套病毒基因组特异性引物以纯化的病毒基因组RNA为模板进行一步法RT-PCR扩增，该套引物共有4条，分别为P1F、P1R、P2F、P2R，扩增产物经纯化后连接至载体，生物学活性分析显示本方法所获得的CWMV全长cDNA克隆能成功地侵染小麦等植物并可在植物体内复制、系统运动和装配，表明该克隆具有侵染活性，可用于相关病毒功能基因组研究和植物抗病性分析。

主权项

一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法，包括以下步骤：1)引物设计：基于本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设计4条引物，其中引物对P1F/P1R用于扩增RNA1,引物对P2F/P2R用于扩增RNA2；2)病毒基因组总RNA提取：取含50‑100μl中国小麦花叶病毒粒子的提取液，利用Trizol试剂按照试剂说明书提取病毒基因组总RNA；3)扩增反应：以提取的病毒基因组RNA作逆转录模板，采用高保真的Phusion DNA聚合酶进行扩增，其中引物对P1F/P1R扩增的RNA1产物长约7.2‑kb，引物对P2F/P2R扩增的RNA2产物长约3.6‑kb；4)病毒cDNA克隆：扩增RNA1和RNA2产物分别用BamHI/SacI、HindI/EcoRI进行双酶切反应，酶切产物经纯化后，分别连接至经过同样双酶切的质粒载体上，转化大肠杆菌,测序验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒pT7‑R1、pT7‑R2。