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一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法，其特征是：包括以下步骤：步骤(1)选取欧李生长状态优良的叶片，流水冲洗30分钟，无菌条件下，直接用体积百分比为75％乙醇对叶片表面消毒1分钟，将叶片平均分成9等份，再用质量百分比为1％NaClO对叶片分别灭菌1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟，然后采用无菌水分别涮洗7次，每次1分钟，将灭菌后的外植体接种到基础盐混合物培养基(MS)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基上，放在每日光照18小时、黑暗6小时、温度25±1℃的培养室内进行培养，7天后统计外植体的污染率和死亡率，每组重复20个外植体，重复3次，合消毒时间为浓度为体积百分比为75％酒精4分钟和浓度为质量百分比1％次氯酸钠4分钟，统计获得欧李叶片污染率最低为0.08％和欧李叶片死亡率为39.54％；步骤(2)：取欧李生长状态优良的叶片，将消毒后的完整叶片切成1cm<sup>2</sup>(立方厘米)，茎段切成2cm(厘米)长的小段，使叶片背面和茎段伤口处充分接触到添加正交设计的不同PGR(PGR‑植物生长调节剂，NAA‑萘乙酸，6‑BA苄氨基嘌呤)浓度的MS培养基上，设置苄氨基嘌呤的浓度梯度是：0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L；NAA‑萘乙酸的浓度梯度是：0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；pH值为5.6‑5.8，加空白对照共17个梯度的培养基愈伤组织诱导培养基中进行培养，接种后的外植体放在温度为25±1℃，光照强度为2.0klx，光照时间为16小时/天的组织培养室中进行培养，15天后进行继代并统计愈伤组织诱导率，每个浓度梯度选取生长状态相近的30个外植体做重复试验，重复3次，添加植物生长调节剂浓度配比为：叶片诱导愈伤组织的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+1.0mg/L6‑BA(6‑BA‑6‑苄氨基嘌呤)+0.6mg/LNAA(NAA‑萘乙酸)，且统计获得的愈伤组织诱导率达到95.31％；茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg6‑BA‑6‑苄氨基嘌呤+0.8mg/NAA‑萘乙酸，且统计获得的愈伤组织诱导率达到92.21％；步骤(3)取生长状态良好的愈伤组织，接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS培养基上，促进愈伤组织生长，6‑BA‑6‑苄氨基嘌呤的浓度梯度是：0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.25mg/L、1.5mg/L；2.4‑天‑2.4‑二氯苯氧乙酸的浓度梯度是：0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养，诱导15个梯度后进行继代，并统计的愈伤组织的生长状况，每组重复50个愈伤组织，统计获得诱导愈伤组织增殖的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/6‑BA‑6‑苄氨基嘌呤+0.6mg/2.4‑二氯苯氧乙酸；步骤(4)将外植体上诱导产生的愈伤组织切成小块，转接到分化芽的MS培养基上，6‑BA(6‑BA‑6‑苄氨基嘌呤)的浓度梯度是：2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L；NAA(NAA‑萘乙酸)的浓度梯度是：0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养，诱导30天后进行继代，并统计的愈伤组织分化芽数量，每组重复40个愈伤组织，诱导愈伤组织生芽的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+5.0mg/苄氨基嘌呤+0.9mg/萘乙酸；步骤(5)将愈伤组织诱导生芽获得欧李芽切下，竖直接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS和1/2MS培养基上，NAA(NAA‑萘乙酸)的浓度梯度是：0mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7、0.9mg/L；IBA(IBA‑吲哚丁酸)的浓度梯度是：0mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L；共24个梯度的诱导培养基培养，诱导30d后进行继代，并统计不同处理中芽的生根率，每个浓度梯度选取生长状态相近的30个幼芽做重复试验，芽诱导生根的培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/萘乙酸；步骤(6)待生根的无菌苗根长长到3‑5cm即可炼苗、移栽。 |
