一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法

摘要

本发明涉及一种RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，它是利用中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)特异的、与病毒复制有关的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因，通过细菌原核诱导表达的方法合成dsRdRp，将该双链RNA添加到饲料中饲喂给1-2日龄幼虫。本发明的双链RNA是用大肠杆菌诱导表达的，成本低，并且对中华蜜蜂囊状幼虫病的防治具有良好的治愈效果。饲喂浓度为0.5μg/ml dsRdRp，幼虫化蛹率和羽化率分别为70%、55%；比饲喂dsGFP的化蛹率（10%）和羽化率（0%）显著高。

主权项

一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：其步骤包括以下：（1）收集患中华蜜蜂囊状幼虫病的幼虫或蛹放置‑80℃冰箱保存；（2）中华蜜蜂囊状幼虫病毒复制基因‑RNA依赖的RNA聚合酶基因的扩增：采用Trizol法提取患病幼虫的总RNA，用RdRp基因的下游引物进行反转录合成cDNA，PCR扩增目的基因片段，将该基因片段连接到PMD18‑T载体，挑取含有该基因片段的单菌落送至华大基因公司进行序列测定；（3）dsRdRp原核表达载体的构建，将（2）中扩增的目的片段，在T4连接酶的作用下连接至L4440载体，16℃连接过夜；将T4酶连接产物转入HT115感受态细胞中，涂布于含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上；（4）dsRdRp的诱导表达：将（3）中阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₅₉₅ = 0.5‑0.6，加入异丙基硫代‑β‑D‑半乳糖苷，即IPTG进行诱导，处理后37℃继续震荡培养4 h，收集菌液，采用CTAB法提取dsRdRp；所述的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨，10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；琼脂，15 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min；所述LB液体培养基配方为：胰蛋白胨，10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min。