单精子多重PCR检测方法

摘要

本发明公开一种单精子多重PCR检测方法，包括以下步骤：A、精子预处理，B、显微操作挑取单个精子以及C、单精子多重PCR。本发明单精子多重PCR检测方法突破了以往对微量细胞的遗传病基因检测只能针对女性卵子和胚胎的局限性，使分析男性生殖细胞是否为嵌合体成为可能。通过本发明方法可以检测到在体细胞和群体精子中无法检测的、仅在单个精子中存在的极罕见的自发突变；能对父亲生殖细胞新生突变引起的父亲年龄效应系列遗传病进行新生突变的辅助诊断分析，在此基础上联合胚胎植入前遗传学诊断技术，预防阻断该类遗传病患儿出生的风险。

主权项

一种单精子多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、精子预处理：(A1)将待检测精液液化后分到离心管内，然后加入培养基F‑10；(A2)均匀吹打，混匀，离心；(A3)弃上清液，再在所述离心管中加入培养基F‑10，与精子沉淀物充分混匀后离心；(A4)弃上清液，将所述离心管底部的精子沉淀物轻柔地打散，然后在所述离心管中加入含血清的培养基F‑10；(A5)将所述离心管孵育45～60min；(A6)取出所述离心管，吸取上清液中云雾状明显的部分，得预处理后的精子；B、显微操作挑取单个精子：(B1)在无菌培养皿内制备聚维酮溶液滴，然后用矿物油覆盖；(B2)制作显微针：制作长度为4.5cm～5.5cm的无菌毛细玻璃管，排出所述无菌毛细玻璃管中的气体，得显微针，所述显微针内径为5～8um，两端平整；(B3)调节倒置显微镜，安装所述显微针至所述倒置显微镜上，通过显微操作仪将所述步骤A预处理后的精子移至所述聚维酮溶液滴中，每个所述聚维酮溶液滴移有一个所述步骤A预处理后的精子；(B4)将另一所述显微针套在口吸管上，在体视显微镜下，分别将所述步骤(B3)后含有单个精子的所述聚维酮液滴转移至PCR管中；C、单精子多重PCR：(C1)在每个所述PCR管中加入裂解液裂解，温育；(C2)选择引物进行多重PCR扩增。