蟾皮提取物中两类组合物成分的检测及鉴定

摘要

本发明提供了一种蟾皮中两类组合物成分的检测及鉴定方法。本发明是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后，进行凝胶色谱分离、ODS纯化得到的，一种或N种多肽组成的组合物。运用HPLC-凝胶层析色谱法，结合已知标准品制备校正曲线，得到：该组合物成分分子量分布范围是1000~10000Da。本发明还涉及一种蟾皮中的脂溶性组合物，是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后以溶剂或者层析色谱的方法得到的一种或N种脂溶性成分组合而成的组合物。照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，联用质谱（HPLC-MS），通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，指认出蟾皮脂溶性组合物中33个色谱峰代表的化合物。

主权项

一种蟾皮提取物的检测方法，其特征在于所述蟾皮提取物包括多肽组合物和脂溶性组合物，该提取物按照以下步骤制备得到：取干蟾皮，洗净，加5‑15倍蒸馏水提取，第一次30‑60分钟，第二次30‑60分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至80℃时相对密度为1.0‑1.4后，分别用40‑70%、75‑90%的乙醇沉淀，滤过，将滤液回收乙醇得到粗提取物；多肽组合物的制备步骤为：使用Sephadex葡聚糖凝胶或聚甲基丙烯酸酯凝胶对粗提取物进行分离和纯化，其中装柱径高比为1:15，上样体积比为1:40，以恒流速3ml/min用去离子水洗脱，按照柱体积1/10进行收集，采用双缩脲反应进行跟踪，收集反应阳性馏分合并后冷冻干燥，得到多肽组合物；脂溶性组合物的制备步骤为：将粗提取物按照1:1的比例与硅胶拌匀，分散，加热混合物至完全干燥，用二氯甲烷进行索氏回流提取，滤过得到提取液，减压干燥，得到脂溶性组合物；检测方法为：(1)采用高效液相‑分子尺寸排阻色谱检测系统联合紫外分光光度检测系统对多肽组合物进行定性的检测，（2）采用高效液相‑质谱联用检测系统（HPLC‑MS）对脂溶性组合物成分进行定性指认；同时所述的步骤(1)中，包括如下步骤：A、多肽组合物的定性检测：标准品配制：生长抑制素 MW 1638、胸腺肽Alpha1 MW 3108、胰岛素MW 5808、                        核糖核酸酶MW 13700，以上标准品加水溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液；供试样品的制备：所述的多肽组合物，加水溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的样品溶液；多肽标准品分析条件为：色谱柱：TSKgel 分子尺寸排阻色谱柱，型号G2000SWXL ，直径‑长度=7.8mm×30cm，以含有0.05%TFA的2:8的乙腈‑水作为流动相，流速0.7 ml/min，在UV 214nm处进行分析；多肽供试品分析条件为：色谱柱：TSKgel 分子尺寸排阻色谱柱，型号G2000SWXL ，直径‑长度=7.8mm×30cm，以含有0.1%TFA的2:8的乙腈‑水作为流动相，流速1.0ml/min，在UV 214nm处进行分析；同时所述的步骤(2)中，包括如下步骤：B、脂溶性成分的定性检测：对照品制备：分别精确称量蟾毒配基类对照品，加甲醇溶解，配置成浓度为0.2mg/ml的混合标准溶液，0.22μm微孔滤膜滤过，即得对照品溶液；所述的蟾毒配基类对照品为：酯蟾毒配基、华蟾酥毒基、日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵；供试品的制备：取所述的脂溶性组合物加甲醇溶解成浓度为4mg/ml的溶液，0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品；分析条件为：分析仪器Solarix FT‑ICR‑MS 9.4T；Agilent 1260高效液相色谱仪；色谱条件：Diamonsil十八烷基键和硅胶色谱柱色谱柱，直径‑长度=4.6mm×250mm，粒径5μΜ；流动相：甲醇（A）‑水（B）；梯度洗脱程序：0‑5 min，5‑20% A；5‑45 min，20‑42% A；45‑70 min，42‑100% A；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：296nm；进样量：10μL；质谱条件：电喷雾离子源喷雾电压：+4000V，干燥气温度：180℃，干燥气流速：4.0 L/min，喷雾气压力：0.5 bar；正离子扫描模式采集，质谱扫描范围m/z：70~1500。