| 主权项 |
毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：该共培养体系建立的方法按以下步骤进行：一、毛脉酸模悬浮细胞的制备：选取颗粒饱满的毛脉酸模种子，用110目～130目砂纸磨去种皮，将去除种皮的毛脉酸模种子浸泡在蒸馏水中18h～26h；然后在无菌条件下用体积分数为70％～75％的酒精浸泡1min～3min，无菌水冲洗3次～5次；再用质量分数为8％～10％NaClO浸泡6min～10min，无菌水冲洗3次～5次，之后将去除种皮的毛脉酸模种子置于两层湿润的滤纸上8h～10h，获得吸水膨胀的毛脉酸模种子；用质量分数为8％～10％NaClO浸泡吸水膨胀的毛脉酸模种子8min～12min，无菌水冲洗3次～5次，得消毒的种子；将消毒的种子接种在不含植物生长激素的MS固体培养基中，置于光照培养箱内培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～8d；获得毛脉酸模无菌苗；利用含有植物激素的MS固体培养基对毛脉酸模无菌苗的下胚轴进行诱导，诱导出愈伤组织；选取生长良好的愈伤组织，接种在含有植物激素的MS固体培养基中，培养温度23℃～27℃，光照12h/d～16h/d，光照强度1500Lx～2000Lx，获得诱导的疏松愈伤组织；将获得诱导的疏松愈伤组织继代培养2次～3次，用无菌镊子夹碎，接种在装有30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基的容器中，培养温度23℃～27℃，100r/min～160r/min黑暗振荡培养；5d～8d后用60目～80目细胞筛去除大的细胞团块；将细胞悬浮培养物摇匀，稍静止，倒出上层培养液，向容器里注入新的含有植物激素的MS液体培养基，继续培养，可得到毛脉酸模悬浮细胞；二、马铃薯固体培养基的制备：取去皮马铃薯180g～220g，切块，加蒸馏水700mL～1000mL，煮沸15min～30min，6层～8层纱布过滤，将滤液倒入容器中，然后向容器里加入18g～20g葡萄糖和15g～20g琼脂，再加入蒸馏水至800mL～1000mL；分装，121℃灭菌20min～30min，得马铃薯固培养基；三、毛脉酸模内生真菌的活化及其孢子悬浮液的制备：将内生真菌接到步骤二制备的马铃薯固体培养基中进行活化培养，即在电热恒温培养箱中培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～5d完成活化；然后在超净工作台内，取3mL～6mL无菌水加入活化培养的毛脉酸模内真生菌的容器中，震荡，接种环刮去孢子，用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到容器中，重复此操作4次～8次，使用无菌水的总体积为25mL～35mL；充分震荡混匀，制得孢子悬浮液；四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌的共培养体系：向容器内加入30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基，培养毛脉酸模悬浮细胞，毛脉酸模悬浮细胞初始接入量为0.1×10<sup>3</sup>个/mL～0.3×10<sup>3</sup>个/mL，培养8d～10d后，接入内生真菌的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.1×10<sup>3</sup>个/mL～0.3×10<sup>3</sup>个/mL，将容器置于摇床上黑暗振荡培养，摇床转速为100r/min～160r/min，培养温度24.5℃～25.5℃，完成毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系的建立；所述诱导出愈伤组织的含有植物激素的MS固体培养基为添加3％～5％蔗糖，0.8％～1.0％琼脂粉、激素2,4‑二氯苯氧乙酸1.5mg/L～3mg/L和6‑苄氨基腺嘌呤2.8mg/L～3.2mg/L的MS培养基；所述获得诱导的疏松愈伤组织的含有植物激素的MS固体培养基为添加3％～5％蔗糖，0.8％～1.0％琼脂粉、2,4‑二氯苯氧乙酸0.5mg/L～1.0mg/L和6‑苄氨基腺嘌呤2.5mg/L～3.0mg/L的MS培养基；所述含有植物激素的MS液体培养基为添加3％～5％蔗糖、2,4‑二氯苯氧乙酸0.5mg/～1.0mg/L和6‑苄氨基腺嘌呤2.5mg/L～3.0mg/L的MS液体培养基。 |
