利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法

摘要

利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，包括以下步骤：（1）采集水稻土样品；（2）进行¹³C-甲酸的微宇宙培育实验；（3）利用超高速离心机对¹³C-甲酸培育土壤的微生物总DNA进行离心分层；（4）对分层后多个浮力密度中的产甲烷古菌基因进行实时定量PCR分析和指纹图谱分析，判断该水稻土中是否含有代谢活性的甲酸利用型产甲烷古菌。综上，本发明通过基于DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）能够敏锐的、原位的揭示稻田甲酸利用型产甲烷古菌，对于了解微生物驱动的稻田养分循环过程和稻田产甲烷古菌功能群的生态功能认知都有重大的意义。

主权项

利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）采集水稻土样品；（2）进行¹³C‑甲酸的微宇宙培育实验: 所述的微宇宙培育实验的步骤为：将100 mg ¹³C‑甲酸加入到装有5克干土重的120 mL玻璃瓶中，用无菌去离子水调至田间土壤最大持水重量的60%，并用氮气置换玻璃瓶中空气后用橡胶塞密封，以保持培养体系的厌氧环境；同时以¹²C‑甲酸和不加甲酸的处理为分别为对照，放置28℃培养箱恒温培养，每隔3天抽出1.2 mL上层空气，利用气相色谱仪测定甲烷气体浓度变化，待甲烷浓度开始降低停止培育实验；（3）利用超高速离心机对¹³C‑甲酸培育土壤的微生物总DNA进行离心分层: 微宇宙培育实验停止后，用土壤DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA；将2.0 µg的土壤微生物总DNA、Gradient Buffer缓冲液和1.85 g/mL氯化铯溶液按0.1 mL、0.9 mL和4.9 mL体积混合，取5.1 mL混合液上超高速离心机；在20℃下45 krpm的离心速度离心44小时；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，每层340 µL体积，分15层；用PEG6000和70%乙醇洗涤每层DNA；（4）对分层后多个浮力密度中的产甲烷古菌基因进行实时定量PCR分析和指纹图谱分析，判断该水稻土中是否含有代谢活性的甲酸利用型产甲烷古菌。