基于磁性分离和多色量子点标记的人流感病毒分型检测的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于磁性分离和多色量子点标记的人流感病毒分型检测的方法和试剂盒，其中，该试剂盒由具有富集人流感病毒抗原功能的抗人流感病毒免疫纳米磁珠、多色量子点标记的抗人流感病毒纳米探针、质控品、样品处理液以及PBST缓冲液所组成；质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；阳性质控品由灭活的人甲、乙流感病毒共同干燥结合到拭子上而成；阴性质控品是经临床确定为人甲、乙流感病毒均为阴性的人群的咽拭子。本发明提供了一种基于磁性分离和多色量子点标记的能简便、快速、高灵敏度的分型检测人流感病毒抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

主权项

一种基于磁性分离和多色量子点标记的人流感病毒抗原分型检测的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)分别将兔抗人甲、乙型流感病毒NP蛋白多克隆抗体与纳米磁珠通过共价偶联，分别制备抗人甲型流感病毒免疫纳米磁珠及抗人乙型流感病毒免疫纳米磁珠；将抗人甲型流感病毒免疫纳米磁珠及抗人乙型流感病毒免疫纳米磁珠等量混合即制得抗人流感病毒免疫纳米磁珠；2)将鼠抗人甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体与发射波长为520nm的纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人甲型流感病毒纳米探针；将鼠抗人乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体与发射波长为600nm的纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人乙型流感病毒纳米探针；将抗人甲型流感病毒纳米探针与抗人乙型流感病毒纳米探针等量混合即制得多色量子点标记的抗人流感病毒纳米探针；3)取人呼吸道分泌物样本，用样品处理液溶解后，加入步骤1)制备得到的抗人流感病毒免疫纳米磁珠，充分混合，反应10‑45min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤2)制备得到的多色量子点标记的抗人流感病毒纳米探针，反应10‑45min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，使用荧光酶标仪在Ex同为405nm，Em分别为520nm及600nm的参数下分别读取荧光值；所述样品处理液中各组分含量分别为：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，0.3g/L NaN₃，5ml/L Nonidet P‑40，5ml/L Triton X‑100，所述样品处理液pH＝7.4；所述PBST缓冲液中各组分含量分别为：8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，0.3g/L NaN₃，0.5ml/L Tween‑20；所述PBST缓冲液pH＝7.4；4)根据步骤1)‑步骤3)的方法分别检测四份经临床确定为人甲、乙型流感病毒均为阴性的人群的呼吸道分泌物样品，分别读取Em分别为520nm及600nm下的荧光值；所述人甲、乙型流感病毒均为阴性的人群的呼吸道分泌物样品简称人流感病毒阴性对照样品；所述四份人流感病毒阴性对照样品在Em为520nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT‑OFF1值；所述四份人流感病毒阴性对照样品在Em为600nm的荧光值的平均值与3倍标准差之和记为CUT‑OFF2值；若步骤3)中人呼吸道分泌物样本在Em为520nm的检测荧光值大于CUT‑OFF1值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人甲型流感病毒抗原为阳性；若步骤3)中人呼吸道分泌物样本在Em为520nm的检测荧光值小于CUT‑OFF1值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人甲型流感病毒抗原为阴性；若步骤3)中人呼吸道分泌物样本在Em为600nm的检测荧光值大于CUT‑OFF2值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人乙型流感病毒抗原为阳性；若步骤3)中人呼吸道分泌物样本在Em为600nm的检测荧光值小于CUT‑OFF2值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人乙型流感病毒抗原为阴性。