一种软骨再生干细胞制剂及其应用

摘要

本发明公开了一种软骨再生干细胞制剂及其应用，步骤包括：血清分离，分离脂肪干细胞，培养脂肪干细胞，软骨再生干细胞制剂的准备和注射治疗。自体血清培养基培养的脂肪干细胞，提高了该干细胞生长，可获得有效性关节治疗制剂；为促进脂肪干细胞转变成软骨，添加适量生长因子(TGF-beta,thrombospondin-2,BMP-2,BMP-7)，做成高效干细胞混合制剂；本发明使用了把干细胞混合制剂直接注射到关节腔这种安全方式。

主权项

一种软骨再生干细胞制剂及其应用，其特征在于，步骤如下：(1)血清分离：从患者身上采集50ml血液，在常温中放置1‑3小时进行凝固；之后以1000‑3000rpm，4℃离心5‑20分钟，收集血清；血清用灭菌的0.2μm网过滤，分装后在‑20℃条件下长期保存；血清使用前在50‑60℃水浴中进行灭活处理20‑40分钟。(2)分离脂肪干细胞：利用一般吸脂术从患者的大腿和/或腹部提取20‑30ml脂肪；提取的脂肪组织利用磷酸盐缓冲液PBS(phosphate buffer sulfate)和裂解缓冲液(lysis buffer)洗涤3‑4次以清除红血球；洗涤完毕后在1.5mg/ml胶原酶(collagenase type I)37℃条件下处理0.5‑2小时，搅拌反应后1000‑2000rpm离心5‑20分钟，分离提取出脂肪干细胞；利用100μm细胞筛过滤，过滤液1000‑2000rpm离心5‑20分钟，分离提取高纯度的脂肪干细胞。(3)培养脂肪干细胞：分离出的高纯度脂肪干细胞在0.5‑2g/L葡萄糖(glucose)，0.5‑2％青霉素(penicillin)或链霉素(streptomycin)，含有5‑20％血清的DMEM培养基在37℃，5％CO₂浓度条件下培养，24小时后更换培养基清除未附着的细胞并每3天更换一次培养基。(4)软骨再生干细胞制剂的准备：培养出的脂肪干细胞通过胰酶‑EDTA(trypsin‑EDTA)处理，用1000‑2000rpm离心10分钟，离心完毕后用PBS溶液洗涤3‑4次；提取1.0×10⁸个脂肪干细胞；用台盼蓝(trypan blue)染色确认细胞的成活率；在这些细胞中添加4‑10ng/ml的细胞生长因子TGF‑beta，50‑200ug/ml的血小板反应蛋白2(thrombospondin‑2)，90‑400ng/ml的重组人骨形态发生蛋白‑2(BMP‑2)，90‑400ng/ml的人骨形态发生蛋白‑7(BMP‑7)后再追加1％透明质酸(hyaluronic acid)1‑2ml制成自体干细胞混合制剂。(5)注射治疗：制成的软骨再生干细胞制剂用24‑26gaze的针头缓慢注射进关节腔内，剂量为1‑3ml。