用于生成成链RNA或DNA文库的方法、组合物和试剂盒

摘要

本发明提供了用于构建定向核酸文库的方法和组合物，包括试剂盒。本发明还提供了用于对定向cDNA文库进行扩增和测序的方法和组合物。

主权项

一种生成定向cDNA文库的方法，该方法包括：a)使一种或多种引物与模板RNA退火；b)在包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP的反应混合物的存在下延伸所述一种或多种引物，其中所述反应混合物包含一定的dUTP与dTTP的比率，其中该比率允许dUTP以所需密度掺入，由此生成包含以所需密度掺入的dUTP的一个或多个第一链互补DNA(cDNA)；c)用尿嘧啶‑N‑糖基化酶(UNG)和能够在由UNG产生的脱碱基位点裂解磷酸二酯骨架的作用物选择性裂解包含以所需密度掺入的dUTP的一个或多个第一链cDNA，其中该裂解生成包含封端3’末端的所需大小的多个第一链cDNA片段；d)使包含部分双链体和3’突出端的第一衔接子与包含封端3’末端的多个第一链cDNA片段中的一个或多个的3’末端退火，其中第一衔接子包含序列A，且其中所述退火包括使在3’突出端的随机序列与在包含封端3’末端的多个第一链cDNA片段中的一个或多个的3’末端处存在的互补序列杂交；e)用DNA聚合酶延伸与所述互补序列杂交的3’突出端，其中生成在一个末端包含序列A的一个或多个双链cDNA片段；和f)将包含序列B的第二衔接子连接至所述在一个末端包含序列A的一个或多个双链cDNA片段，其中所述连接生成在一个末端包含序列A且在相反末端包含序列B的一个或多个双链cDNA片段，由此生成定向多核苷酸文库。