一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法

摘要

一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，先分离出牡丹SINE类反转录转座子的部分序列，根据其序列设计引物；以所设计引物进行PCR反应，得到生物素标记的探针；提取牡丹基因组后进行酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集；将生物素标记的探针与所得基因组片段杂交，筛选出目的片段；所得目的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。本发明提供的分离牡丹SINE类反转录转座子序列的方法，为开发基于牡丹SINE类反转录转座子的分子标记提供基础。

主权项

一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于，具体操作步骤为：步骤一、牡丹SINE类反转录转座子的部分序列的分离：根据真核生物SINE类反转录转座子的保守序列Box A和Box B区域，以两个单引物分别进行PCR扩增，将两次PCR扩增出的产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子的部分序列；所用的两个单引物序列为：引物A  5'‑TGGCCTAGTGG‑3'；引物B  5'‑GAGGAYTTG AACC‑3'；步骤二、生物素标记的探针的制备：根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列设计5’端生物素标记的探针引物，以质粒DNA为模板进行PCR，得到生物素标记的探针；所设计的生物素标记的探针引物的序列为：PTSB01 5'‑TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG‑3'；PTSB02 5'‑AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA‑3'；其中PTSB01进行5’端生物素标记；步骤三、基因组片段富集库的制备：提取牡丹基因组DNA，然后以限制性内切酶Bsp143I进行基因组酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后通过T4连接酶将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集，得基因组片段，备用；形成双链的寡聚核苷酸接头的两条寡聚核苷酸链分别为：Adaptor 1       5'‑GTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGT‑3'；Adaptor 2        3'‑CCCGGCTCCACTAG‑5'；单引物的PCR扩增进行基因组片段库的富集，所用引物为：Adapcr     5'‑GTAATACGACTCACTATAGGGC‑3'；步骤四、目的片段的筛选、扩增与测序：将生物素标记的探针与步骤三中所得基因组片段杂交，通过MagneSphere磁珠筛选出目的片段；将筛选出的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后，进行测序和序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列；所述的生物素标记的探针和基因组片段杂交步骤为，在PCR管中，将250ng ‑500ng步骤三中回收得到的基因中片段与50‑80pmol步骤二中制得的生物素标记探针混合后，加入21μL 10 X SSC溶液和0.7 μL 10%SDS溶液，然后加水至100 μL；在95℃ 3min变性，室温15min退火，形成生物素探针和基因组片段杂交产物；所述的磁珠法筛选目的片段的方法为，取0.6ml的MagneSphere磁珠，然后用SSC溶液洗三次；洗过的磁珠用100 μL 0.5×SSC溶液重新悬浮后，加入生物素探针和基因组片段杂交产物，在室温下放置30min；用0.5×SSC 溶液洗脱掉悬浮液中没有结合到磁珠上的DNA片段；使用磁力架来筛选出与磁珠结合的生物标记探针与目的片段的混合物，将目的DNA混合物通过50μL灭菌双蒸水在94℃下5min洗脱出来，得到目的片段。