一种改良猪肌肉品质的方法

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种改良猪肌肉品质的方法。本发明的特证是：将PPARγ基因作为提升肌肉品质的重要候选基因，建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系，通过电转染的方法将SwaI线性化的pN1-MCK-PPARγ2表达载体转入大白猪30日龄胚胎成纤维细胞内，使用体细胞核移植的方法制备PPARγ转基因猪，在转基因猪中验证肌肉组织超表达PPARγ基因对肌内脂肪沉积等肉质性状的影响，克服了传统的动物育种中同时选择肉质和肉量的矛盾，为培育出良好肌肉品质的瘦肉猪新品种提供一种新的方法。

主权项

一种改良猪肌肉品质的方法，包括克隆如SEQ ID NO：1所示序列的PPARγ基因，制备调控PPARγ基因的如SEQ ID NO：2所示序列的启动子MCK，构建得到超表达PPARγ基因的载体pN1‑MCK‑PPARγ2；其特征在于，还包括通过体细胞核移植获得转PPARγ基因猪，其制备步骤如下：(1)建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系，通过电转染的方法将SwaI线性化的pN1‑MCK‑PPARγ2表达载体转入大白猪30日龄胚胎成纤维细胞内，作为体细胞核移植的供体细胞；(2)利用浓度为500μg/ml的G418对电转染后的猪胎儿成纤维细胞进行毒性筛选；(3)当阳性PPARγ单克隆细胞长满后培养接触抑制2天后，采用消化和离心方法，加入200μl显微操作液重悬细胞沉淀，作为供体细胞进行后续显微操作；(4)采卵后，挑选形态规则、外围有3层以上的卵丘细胞紧密包围、胞质致密均匀的卵丘卵母细胞复合体，以50COCs/500μl的数量进行聚集培养；取出后用卵泡液稀释的0.1％浓度的透明质酸酶、消化成熟后的COCs，在体视镜下挑选排出具有第一极体、卵黄膜完整、卵周隙清晰、胞质均匀的卵母细胞；将浓度为7.5μg/ml的细胞松弛素B溶解于操作液中，制成显微操作滴；同时采用纺锤体成像系统定位极体，用注射针去核，并将供体细胞注入透明带下；将重构卵移入盖有石蜡油的胚胎培养液PZM‑3中进行平衡，于38℃，5％CO₂和100％相对湿度的培养箱中平衡10min；(5)向细胞融合仪施加一个30μs，120V/mm，2D的直流电脉冲诱导融合并同时激活重构卵，然后进行胚胎移植，获得转PPARγ2基因克隆猪；(6)在形态学、DNA、RNA和蛋白水平上对转PPARγ2基因猪的肌内脂肪含量和肌肉肉质性状进行检测分析；其中：步骤(1)中所述的超表达PPARγ基因的pN1‑MCK‑PPARγ2载体包含有如序列表SEQ ID NO：1所述的序列和SEQ ID NO：2所述的序列；步骤(3)所述的显微操作液按如下方法配制：在600ml的去离子水中，按顺序加入9.500g的TCM‑199，0.050g的碳酸氢钠，0.750g的HEPES，1.855g的氯化钠、0.050g的青霉素、0.060g的链霉素、3.0g的牛血清白蛋白，使用前现加；溶解后将pH调至7.2‑7.4，用去离子水定容至1L，保持渗透压为280mOsm，接着用0.22μm滤器过滤，用封口膜封存后于4℃备用；步骤(4)中所述的胚胎培养液PZM‑3按如下方法配制：在60mL的去离子水中，按顺序加入0.6312g的氯化钠、0.0746g的氯化钾、0.0048g的磷酸二氢钾、0.0099g的七水硫酸镁、0.2106g的碳酸氢钠、0.0022g的丙酮酸钠、0.0617g的五水乳酸钙、0.0146g的谷氨酰胺、0.0546g的亚牛磺酸、5mg的庆大霉素、fatty acid free牛血清白蛋白0.3g；调pH至7.2‑7.4，用去离子水定容至100ml，保持渗透压为286‑290mOsm，接着用0.22μm滤器过滤除菌，分装后用封口膜封存于4℃下保藏。