酒类中氨基甲酸乙酯的高灵敏时间分辨荧光免疫分析方法

摘要

酒类中氨基甲酸乙酯的高灵敏时间分辨荧光免疫分析方法，属于时间分辨荧光免疫分析技术领域。本发明以氨基甲酸乙酯－牛血清蛋白作为免疫抗原获得多克隆抗体，以氨基甲酸乙酯－卵清蛋白人工抗原包被96孔板为固相抗原，与氨基甲酸乙酯标准或样品中的氨基甲酸乙酯共同竞争多抗；用Eu³⁺标记的羊抗兔抗体进行示踪；本发明方法的灵敏度为3.26μg/L，批内和批间变异分别为3.3％和6.7％，平均回收率为92.4％，与甲氨、刀豆氨酸等的交叉反应率低于10％。不同时间进行的氨基甲酸乙酯－TRFIA，0浓度点计数的20％、50％、80％时的效应点对应的浓度(ED20、ED50、ED80)分别为18.6±1.63μg/ml、5.47±0.319μg/ml和1.071±0.083μg/ml。检测范围为1μg/ml－20μg/ml。

主权项

1.酒类中氨基甲酸乙酯的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征是以氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，获取氨基甲酸乙酯多克隆抗体，以氨基甲酸乙酯-卵清蛋白人工抗原包被96孔板为固相抗原，与氨基甲酸乙酯标准或样品中的氨基甲酸乙酯共同竞争多抗；用Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪；(1)氨基甲酸乙酯标准的配制：从氨基甲酸乙酯纯品中稀释，氨基甲酸乙酯浓度分别为0、0.01、0.05、0.2、1.0、5和20μg/mL，稀释液为pH7.4、10mmol/L的PBS；(2)Eu3+-羊抗兔抗体标准的配制：Eu3+-羊抗兔抗体用分析缓冲液稀释为10μg/mL；(3)分析缓冲液：含8mmol/L NaCl、0.1％牛血清蛋白、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的pH 7.8 Tris-HCl缓冲液；(4)封闭液：含0.2％明胶的pH 7.2 Tris-HCl缓冲液；(5)洗涤液：0.1ml/L Tween-20的pH 7.8 Tris-HCl缓冲液；(6)增强液：含15μmol/L β-二酮体、50μmol/L三辛基氧化磷、0.1％TritonX-100、pH 3.2的醋酸和邻苯二甲酸氢钾缓冲液；(7)半抗原的制备：以尿素和乙二醇为起始原料，胺解得到中间产物氨基甲酰基乙醇，然后对其进行氧化，得到氨基甲酰基乙酸，即为氨基甲酸乙酯半抗原；以含10mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸的甲醇为流动相进行分析纯化，使用LC-MS定性分析；(8)人工抗原的合成：采用碳二亚胺偶合法分别制备免疫所用的氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白人工抗原，固相筛选所用的氨基甲酸乙酯-卵清蛋白人工抗原，制备方法如下；将干燥后的2.5mg氨基甲酸乙酯半抗原振荡溶解于0.1mL的ddH2O，调节pH 4.7-7.2，振荡混合0.2mL 10mg/mL牛血清蛋白或卵清蛋白，加入10mg/mL碳二亚胺溶液0.1mL，偶联2h；Superdex G-25凝胶柱，以生理盐水为流动相分离，收集在280nm处有吸收峰的组分，即氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白或氨基甲酸乙酯-卵清蛋白，冻干保藏；氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白用作免疫抗原，氨基甲酸乙酯-卵清蛋白用作包被抗原；(9)微孔板的包被：将氨基甲酸乙酯-卵清蛋白用pH 9.6 100mmol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液稀释至5μg/mL的包被液，96孔微孔板各孔加100μL，4℃过夜，弃去包被液，用ddH2O冲洗两次，加200μL封闭液封闭，静置2h，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存；(10)检测步骤：间接竞争氨基甲酸乙酯的时间分辨荧光免疫检测步骤：取氨基甲酸乙酯-卵清蛋白板条，加入50μl/孔的氨基甲酸乙酯标准或处理好的样品到各自的微孔中，加用分析缓冲液以1∶5000稀释的抗氨基甲酸乙酯多抗50μl/孔，37℃振荡1小时，用洗涤液洗三次，再加用分析缓冲液稀释的10μg/mL Eu3+-羊抗兔抗体100μl/孔，37℃振荡0.5小时，用洗涤液洗六次，加200μl/孔的增强液振荡5分钟后，用时间分辨荧光免疫仪测定CPS值，并绘制出抑制百分率对氨基甲酸乙酯浓度μg/mL的标准曲线，再从标准曲线计算样品中的氨基甲酸乙酯含量。