一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法

摘要

本发明公开了本发明涉及一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，属于生物技术领域。是通过PCR方法从淀粉液化芽孢杆菌ES-2菌株基因组中扩增得到450bp的同源序列，从质粒pHB201上扩增启动子P59序列，将上述两个DNA片段连接到一起，并克隆到质粒pMD19-T上，并连接上新霉素抗性基因做为筛选标记，从而构建了一个同源整合载体。将构建好的同源整合载体转化到野生淀粉液化芽孢杆菌ES-2中，启动子置换菌株的fengycin产量为5704.77±258.89mg/L，比野生菌的fengycin产量提高了约0.65倍。

主权项

一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，是将野生型淀粉液化芽孢杆菌ES 2的fengycin合成酶基因的启动子Ppps置换为启动子P59的方法，其特征在于，1)启动子P59序列的克隆设计启动子P59的引物：上游引物：5’ ctttattgttttgccatt 3’下游引物：5’ ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta 3’采用上述引物并以质粒pHB201做为模板，扩增获得一个长377bp的P59启动子序列；2)fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆设计淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5’端的DNA片段引物序列，上游引物：5’ tactttatttgaagtttgttatttcactttcttatcc 3’下游引物：5’ ccaaacttcttgtctg 3’以淀粉液化芽孢杆菌ES 2基因组DNA为模板，扩增获得一个长450bp的fengycin合成酶基因同源片段SEQ ID NO.1，即淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5’端部分片段；设计新霉素抗性基因的引物，上游引物：5’ ccggaattcgcgaccttccactcaccggtt 3’下游引物：5’ ccggaattccggggcaatgaaattagactat 3’从质粒pMK3扩增得到新霉素抗性基因片段1153bp；3)同源整合载体的构建将PCR产物分别纯化后，通过SOE PCR的方法将启动子P59DNA片段和fengycin合成酶基因同源片段连接到一起，ddH2O重溶，与pMD19 T载体连接，得到质粒载体pMD19 T1，然后在质粒载体pMD19 T1的EcoRI位点加上新霉素抗性基因，得到质粒载体pMD19 T2，将pMD19 T2转化大肠杆菌TOP10F’，获得同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F’；4)同源整合载体转化淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES 2将同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F’，提取同源整合载体质粒，转化感受态淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES 2，获得同源整合载体转化的淀粉液化芽孢杆菌ES 2菌株，即启动子P59置换的菌株。