一种亚洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法及其试剂盒和应用

摘要

本发明公开了一种亚洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，包括以下步骤：1）储备亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原；2）纯化定量亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原146S；3）建立亚洲Ⅰ型口蹄疫间接夹心ELISA方法；4）绘制标准对照抗原标准曲线；5）计算被检样品146S抗原含量；6）检测敏感性和特异性。并提供了应用此检测方法的试剂盒。本发明的有益效果为：本发明提供的一种亚洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法在测定口蹄疫抗原的含量时，既能计算出抗原含量，又能对抗原进行分型，以其原理制备的试剂盒，敏感、特异、操作简单、省时省力、稳定性好、适合于批量检测，且能区分血清型。

主权项

一种亚洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）储备亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原：对亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原，一部分按5mL/瓶，置于‑70℃储备，此部分仅解冻一次，用于ELISA试验；另一部分按3×100 mL，置于‑70℃储备，此部分仅解冻一次，分三次用于146S抗原纯化定量；2）纯化定量亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原146S：是利用蔗糖密度梯度法，梯度浓度为45%、35%、25%、15%，纯化亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原，三次测得146S抗原含量的平均值为1.74μg/ml；3）建立亚洲Ⅰ型口蹄疫间接夹心ELISA方法，过程具体如下：a）包被ELISA板：用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释口蹄疫亚洲Ⅰ型兔抗血清至工作浓度，工作浓度为1:1000，即将1µl口蹄疫亚洲Ⅰ型兔抗血清加入1000µl碳酸盐包被缓冲液中，混匀，每孔加50µl于底部，震荡2‑3分钟后用封板膜封板或置湿盒中室温过夜；b）洗涤ELISA板：揭掉封板膜，弃去ELISA板中液体，每孔加满洗涤液，洗涤液为0.01M， pH 7.4的磷酸盐吐温缓冲液，1×PBST，静置30秒后弃去液体，重复4次，拍干；c）加样：用1×PBST将对照抗原和被检抗原从1:2，即50µl抗原加50µl PBST，开始做2倍连续稀释至1:256，每孔加50µl，37℃，温育1小时，用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；d）加二抗：用豚鼠抗血清稀释液稀释口蹄疫亚洲Ⅰ型豚鼠抗血清至工作浓度，工作浓度为1:1000，即将1µl口蹄疫亚洲Ⅰ型豚鼠抗血清加入1000µl豚鼠抗血清稀释液中，豚鼠抗血清稀释液为含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST，每孔加50µl，封板，37℃，温育1小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；e）加酶：用1×PBST稀释兔抗豚鼠‑辣根过氧化物酶结合物至工作浓度，工作浓度为1:500，即将2µl兔抗豚鼠‑辣根过氧化物酶结合物加入1000µl PBST中，每孔加50µl，37℃温育1小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；f）显色：每孔加50µl底物溶液，37℃温育15分钟，所述底物溶液为20mmol/L邻苯二胺OPD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H₂O₂；g）终止：每孔再加50 µl 终止液终止反应，所述终止液为浓度为1.25%的H₂SO₄；h）测定：在490nm 波长下读取光吸收值；4）绘制标准对照抗原标准曲线：是以标准对照抗原的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线；5）计算被检样品146S 抗原含量：是以样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；或以标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；6）检测敏感性和特异性：是将亚洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原作系列稀释，用标准对照抗原的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式的最小抗原含量，将待测口蹄疫抗原作为被检抗原时，检测反应OD值小于标准对照抗原的敏感性检测值。