CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用；该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统同时高效地将GFP基因和mCherry基因分别重组到伪狂犬病毒gE基因和TK基因位点，得到gE基因和TK基因的条件性缺失毒株。纯化后，再利用Cre/lox系统将伪狂犬病毒重组毒基因组中的外源GFP和mCherry基因切除，进而快速纯化得到缺失gE/TK双基因缺失的伪狂犬病毒活疫苗。对多基因同时进行操作，将传统方法中多基因敲除的多轮流程，缩减到一轮；同时，CRISPR/Cas9和Cre/lox系统对病毒基因的高效率编辑，将三十代左右的空斑纯化过程，简化到3-4代，大幅提高了病毒疫苗制备的效率，是有效防控变异伪狂犬病毒更大范围流行和减少重大经济损失的有力保证。

主权项

一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据伪狂犬病毒目的基因基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA；再在目的基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列；2)将目的基因的sgRNA双链寡聚核苷酸与线性化的质粒载体连接，转化提取得到目的基因的sgRNA表达载体；3)靶向伪狂犬病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段的构建；a、体外扩增伪狂犬病毒目的基因上游同源臂hm1和下游同源臂hm2，纯化；b、体外扩增外源筛选基因，并将扩增外源筛选基因插入含有同向成对的lox序列的线性化的载体内；c、PCR体外扩增得到lox‑外源筛选基因‑lox片段，再进行融合PCR扩增得到hm1‑lox‑外源筛选基因‑lox‑hm2片段；4)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将hm1‑lox‑外源筛选基因‑lox‑hm2片段与目的基因的sgRNA表达载体混合转染，得到转染细胞；5)将转染细胞感染伪狂犬病毒野毒株，得到伪狂犬病毒多基因缺失病毒；6)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将Cre/lox系统表达质粒进行转染，得到转染细胞；7)将转染细胞感染伪狂犬病毒多基因重组病毒，得到伪狂犬病毒多基因缺失病毒，纯化得到伪狂犬病毒多基因缺失疫苗株。