一种多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法及其激酶检测应用

摘要

本发明公开了一种以葡萄糖氧化酶功能化的金纳米粒子为探针的电致化学发光生物传感器构建方法及其在蛋白质激酶活性检测和抑制剂筛选中的应用，属于电致化学发光领域。将生物素标记的DNA和GOx共轭修饰到Au NPs表面制备多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA；在蛋白质激酶A和三磷酸腺苷的作用下，修饰于电极表面的多肽发生磷酸化，通过抗原-抗体的特异性识别作用，将生物素标记的抗磷酸化丝氨酸抗体结合到多肽的磷酸化位点上；再利用亲和素对生物素反应的介导作用，将GOx/Au NPs/DNA捕获到电极表面。蛋白质激酶A的浓度越大，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装于传感界面的GOx就越多，GOx催化葡萄糖产生的H₂O₂越多，鲁米诺的发光越强，实现了对蛋白质激酶A的高灵敏检测。

主权项

多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：（1）Au NPs的制备：将50 mL浓度为0.05 g/L的氯金酸加入到100 mL的圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入5 mL质量百分浓度为1%的柠檬酸钠溶液并持续沸腾10 min，当溶液颜色由黄色变成深酒红色时，即获得平均粒径为14 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 °C保存备用；（2）GOx/Au NPs/DNA多功能纳米探针的制备：先将0.3 mL生物素标记的DNA溶液加入到5 mL步骤（1）制备的Au NPs溶液中，孵化24 h，将DNA修饰的Au NPs分散于0.1 M NaCl溶液中；将0.2 mL浓度为2 mg/mL的GOx加入到0.2 mL上述溶液中，25 °C搅拌1 h，再加入1 mL质量百分浓度为1%的牛血清白蛋白溶液以封闭Au NPs表面多余的活性位点；将得到的溶液于13000 rpm离心10 min，除去上层清液后得到多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA，将其重悬于磷酸盐缓冲溶液中备用；（3）ECL传感器的组装：金电极在修饰之前，先分别在粒径为1.0、0.3和0.05 μm的α‑Al₂O₃糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1 min，在0.5 M的H₂SO₄中于‑0.2~1.55 V电位范围内循环伏安扫描，直到得到重复性良好的循环伏安曲线为止；将清洗好的金电极浸入100 µM半胱氨酸终端的多肽溶液中反应16 h，用空白磷酸盐缓冲溶液清洗后，将多肽修饰电极插入5 mM巯基己醇溶液中，室温下反应1 h以封闭金电极表面的非特异性吸附位点；再将电极插入含有蛋白质激酶A和三磷酸腺苷的检测缓冲溶液中，室温下反应1 h，此时，蛋白质激酶A将三磷酸腺苷上的磷酸根转移到多肽链上氨基酸残基的‑OH位点上，从而获得磷酸化多肽修饰电极；随后将磷酸化多肽修饰电极插入生物素化的抗磷酸化丝氨酸抗体中室温下孵化1 h，再插入200 μL浓度为0.1 mg/mL的亲和素溶液中，室温下反应30 min；最后将电极插入200 μL的GOx/Au NPs/DNA溶液中，室温下孵化30 min，即制得ECL生物传感器。