C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清及其制备方法

摘要

本发明涉及一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清及其制备方法；是将C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上复苏，再使用营养肉汤增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚膜梭菌菌液，再利用产毒培养基培养灭活，对血清进行基础免疫和加强免疫后分离得到。本发明制备的C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，效价高、特异性强、无毒副作用；可用于动物的C、D型产气荚膜梭菌病的免疫，可在研究预控控制C型、D型或C、D两型产气荚膜梭菌感染引起的羊猝狙，肠毒血症等病的流行中起到重大作用。

主权项

一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，其特征在于通过以下方法制备得到：1)将3ul C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上复苏后使用营养肉汤培养基增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚膜梭菌菌液；2)将4ml C型产气荚膜梭菌菌液和3ml D型产气荚膜梭菌菌液加入到100ml pH7.5的产毒培养基中，在厌氧环境下振荡培养，44℃培养5h高效产毒，然后4℃4000g离心15min，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌,得到C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液，作为C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第二免疫原；3)在C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液中加入其体积比0.3％的甲醛溶液，充分振荡混匀，37℃灭活128h，期间每隔5‑6h振摇一次，得到灭活好的C、D型产气荚膜梭菌类毒素溶液；按照CD型产气荚膜梭菌类毒素溶液和白油佐剂体积比1:2向灭活好的C、D型产气荚膜梭菌类毒素溶液中加入灭菌的白油佐剂乳化，得到C、D型产气荚膜梭菌二价白油类毒素疫苗，作为C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第一免疫原；4)C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清制备分为基础免疫和加强免疫；先用第一免疫原对成年健壮的健康绵羊进行两次基础免疫：肌肉分点注射C、D型产气荚膜梭菌二价类毒素白油疫苗；再使用第二免疫原进行四次加强免疫：肌肉分点注射除菌C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液；具体免疫程序如下表：免疫程序5)最后一次免疫10d后静脉无菌采血，分离血清，得到C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清；所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5ml绵羊血；所述的营养肉汤培养基成分：100毫升蒸馏水、蛋白胨1g、牛肉粉0.3g、生理盐水0.5g；所述的产毒培养基成分为：每100mlPBS缓冲液溶解3g胰蛋白胨、2g糊精、2g酵母浸膏和2.2gL‑精氨酸；PBS缓冲液成分为：1L去离子水、0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、8g氯化钠(NaCl)和0.2g氯化钾(KCl)。