一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法

摘要

本发明公开了一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法。本发明用于从蜡样芽胞杆菌R75E的液体培养物中纯化胶原酶，包括粗酶液的获得和高纯度胶原酶的柱层析制备过程；粗酶液的获得：在LB肉汤固体培养基上划线复苏蜡样芽胞杆菌R75E三代，扩培后离心所得上清液；高纯度胶原酶的柱层析制备由两步柱层析步骤即可得到高纯度胶原酶。本发明为工业化大规模生产胶原酶提供了重要的技术参数，弥补了国内在柱层析纯化微生物胶原酶方面的技术空白。

主权项

一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法，其特征是，用于从蜡样芽胞杆菌R75E的液体培养物中纯化胶原酶，包括粗酶液的获得和高纯度胶原酶的柱层析制备过程；所述粗酶液的获得过程为：(1)在LB肉汤固体培养基上划线复苏蜡样芽胞杆菌R75E三代；(2)挑取单克隆接种至LB肉汤液体培养基中，在37℃条件下振荡培养12h；(3)按照1％的接种量在37℃条件下扩大培养24h；(4)培养结束后在4℃条件下12000rpm/min离心20min，所得上清液即为R75E的粗酶液；所述高纯度胶原酶的柱层析制备过程，按照如下步骤进行：(1)盐析：按照硫酸铵在0℃条件下的饱和度表，根据粗酶液的体积数向粗酶液中边搅拌边缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度达到40％，在冰浴条件下持续搅拌12小时后，4℃冷冻离心，离心条件为12000rpm/min，20min；弃沉淀，保留上清液；继续向上清液中加入硫酸铵粉末至硫酸铵饱和度达到60％，在冰浴条件下持续搅拌12小时后，4℃冷冻离心，离心条件为12000rpm/min，20min；保留沉淀，弃上清溶液；将所得沉淀用缓冲液B2溶解；所述缓冲液B2即PBS缓冲液，配制方法为在800mL去离子水中加入0.2mol/L的Na₂HPO₄ 81mL、0.2mol/L的NaH₂PO₄ 19mL，用去离子水定容至1L；(2)疏水相互作用层析，过柱条件为：①用10mL超纯水以1mL/min的流速洗蛋白纯化柱；②用10mL缓冲液B3以1mL/min的流速平衡蛋白纯化柱；③向步骤(1)所得的B2溶解的蛋白溶液中加入硫酸铵粉末，调节其电导率值至170mS/cm，即获得待蛋白纯化柱疏水层析分离所需的样品液；以1mL/min的流速将样品液上样至蛋白纯化柱；④全部上样结束后，继续用20mL缓冲液B3以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱；⑤利用缓冲液B2对结合在蛋白纯化柱上的胶原酶进行线性梯度洗脱，逐渐降低洗脱液中的硫酸铵浓度，使溶液的电导率在40min内由170mS/cm逐渐降至0mS/cm，通过蛋白纯化仪上的紫外检测仪监测蛋白的紫外吸收峰情况，并收集洗脱下来的蛋白；⑥SDS‑PAGE电泳检测洗脱下来的蛋白，跟踪目标蛋白；⑦将含有胶原酶的洗脱液合并，并进行超滤浓缩，条件为4℃，4000rpm/min，6分钟，最终将胶原酶蛋白溶液浓缩至1mL,并将该溶液标记为S1；所述蛋白纯化柱为HiTrap^TMButylFF疏水层析柱；所述缓冲液B3其配制方法为：在800mL PBS缓冲液中加入硫酸铵粉末132.14g，用去离子水定容至1L；(3)分子筛层析过柱条件为：①以0.5mL/min的流速用超纯水润洗Superder^TM200分子筛纯化柱，总润洗水的体积为120mL；②用120mL缓冲液B2以0.5mL/min的流速平衡Superder^TM200分子筛纯化柱；③将S1样品液以0.5mL/min的流速上样至Superder^TM 200分子筛纯化柱；④以1mL为体积单位收集蛋白洗脱液，并进行SDS‑PAGE电泳检测，跟踪目标蛋白；⑤合并包含胶原酶蛋白的洗脱液并进行超滤浓缩，条件为4℃，4000rpm/min，6分钟，最终将胶原酶蛋白溶液浓缩至1mL，即获得高纯度胶原酶。