榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法

摘要

本发明公开了一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法，填补了缺少芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜种质的空白；本发明利用芸薹属蔬菜种质榨菜和紫甘蓝进行杂交，授粉后7天摘取子房，利用胚拯救获得成熟的种子，种子萌发后经过继代、扩繁获得大量的有性后代，经过杂种确定后，利用添加秋水仙素的液体培养基对单倍体进行加倍处理获得多基因组异源六倍体蔬菜种质。本发明可操作性强，简单实用，节省获得多基因组多倍体材料的时间，可以广泛应用于花科芸薹属蔬菜类种质的种间杂交的胚抢救，对于特殊植物新品种的培育和育种具有重要的意义。

主权项

一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：   （1）芸薹属榨菜作为母本，芸薹属紫甘蓝作为父本进行有性杂交，授粉7天后摘取子房；所述授粉为连续两天重复授粉两次；   （2）将子房消毒并冲洗；   （3）将子房置于铺有用浓度为0.03 g/mL的蔗糖溶液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，剖开子房一端后沿腹缝线撕开，将胚珠连同胚柄及与胚柄相连的子房壁组织一同切下并接种到发育培养基上；于25±2°C黑暗条件下培养24h，再光照条件下培养40天，光照强度为40 μmol·m^‑2·s^‑1、光照时间为12小时/天；所述发育培养基由MS、蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭和水组成，蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.0004 g/mL、0.002g/mL，余量为水，pH为5.8；   （4）将成熟种子摘下接种于发芽培养基上于25±2°C黑暗条件下培养；所述发芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6‑苄氨基嘌呤和水组成，蔗糖、琼脂、6‑苄氨基嘌呤的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量为水，pH为5.8；   （5）在种子萌发后30天将幼苗先转移到继代培养基、扩繁培养基上继代扩繁, 培养条件为温度为25 ± 2°C、光照强度为80 μmol·m^‑2·s^‑1、光照时间为12小时/天；所述继代培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂和水组成，蔗糖、琼脂的质量含量分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL，余量为水，pH为5.8；继代所采用的外植体为带2枚真叶的单芽茎段；所述扩繁培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6‑BA和水组成，蔗糖、琼脂、6‑BA 的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量为水，pH为5.8；扩繁所采用的外植体为附带腋芽的茎段；   （6）组培幼苗具有4片真叶时，对其幼嫩叶片进行RAPD多态性分析及流式细胞鉴定，获得榨菜与紫甘蓝种间真杂种，所述RAPD为随机扩增的多态性DNA；            （7）对鉴定为真杂种的幼苗进行加倍处理，加倍方法是利用添加秋水仙素的加倍液体培养基对单倍体茎段进行振荡培养，28°C，150 rpm振荡培养两天；所述的加倍液体培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6‑BA、α‑萘乙酸（NAA）和水组成，蔗糖、琼脂、6‑BA、α‑萘乙酸的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、2 mg/L、0.1 mg/L，余量为水，pH为5.8；秋水仙素终浓度为100 mg/L；   （8）处理完毕后的外植体用无菌水冲洗干净后转移到不含秋水仙素的诱导芽培养基上培养诱导腋芽的产生，腋芽生长20天后切下转移到1/2MS培养基上生长，幼苗具有4片真叶时利用流式细胞术进行倍性的鉴定；所述诱导芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6‑BA和水组成，蔗糖、琼脂、6‑BA 的质量浓度分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量为水，pH为5.8；   （9）将加倍成功的幼苗移到生根培养基上进行生根培养，将生根后的幼苗取出，移栽至装有基质的营养钵中炼苗，炼苗时，先在幼苗上覆盖薄膜并遮荫，在炼苗3天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境；最终获得芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜新种质；所述生根培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、NAA和水组成，蔗糖、琼脂、NAA的质量体积比分别为0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.1 mg/L，余量为水，pH为5.8。