| 主权项 |
端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，整个过程均在无菌条件下操作，包括以下步骤：(1)选择卵期在10‑20天之间的的端黑萤胚胎；(2)端黑萤胚胎灭菌处理：用萤火虫胚胎灭菌液对选择的端黑萤胚胎进行表面清洁、消毒、杀菌和灭真菌；(3)端黑萤胚胎的去卵壳处理；(4)端黑萤胚胎与冷冻保护液平衡：将端黑萤胚胎置于20％、30％、50％、70％和100％冷冻保护液依次进行五步平衡处理；(5)平衡处理后的端黑萤胚胎与冷冻保护液混合物装入麦管或置于铜箔片上，投入液氮中冷冻保存；(6)从液氮中取出置于复温液中复温；(7)26℃‑28℃、80％‑90％湿度的条件下进行孵育，其中所述的冷冻保护液由基础液、小分子抗冻剂和玻璃化保护剂组成，复温液由基础液和小分子复温剂组成，基础液为改进的Grace培养液，其中酵母提取物占0.1‑1.0％，水解酪蛋白占0.1‑0.8％，小分子抗冻剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇中的两种以上，玻璃化保护剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、胎牛血清、白蛋白中的两种以上。 |
