一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法

摘要

本发明提供一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法，经过样品前处理方法、单细胞悬液的制备、细胞浓度计算、细胞接种、加入受试物、孵育受试物、收获细胞、低渗、滴片、染色、微核计数、结果判定等步骤。本发明综合考察口含烟制品的暴露途径，作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法，且根据口含烟制品作用靶细胞选取了人口腔粘膜成纤维细胞hOMF作为口含烟制品体外微核试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的体外微核试验检测方法。

主权项

一种检测口含烟制品对细胞微核率影响的方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）样品前处理方法：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；（2）单细胞悬液的制备：人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37℃、5%CO₂、95%RH培养箱中培养，待细胞汇合率约80～90%时移除培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL‑2mL浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，加入DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；（3）单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；（4）细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至1.0～1.5×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH培养箱内培养24h；（5）受试物分为三组：阴性对照组、阳性对照组和检测样品组；阴性对照组加DMEM/F12细胞培养基；阳性对照组加浓度为0.2μg/mL的环磷酰胺溶液；检测样品组加不同剂量的步骤（1）所得待测液；（6）剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量：1400μg/mL、700μg/mL、350μg/mL、175μg/mL；（7）移除步骤（4）中6孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5）进行分组，在阴性对照组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加浓度为0.2μg/mL的环磷酰胺溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1）所得待测液，使终浓度分别为步骤（6）设定的剂量；阴性对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为2mL/孔；再在阴性对照组、阳性对照组和检测样品组中均加入细胞松弛素，使其在每个细胞培养孔中的终浓度为3μg/mL；（8）孵育受试物：将步骤（7）加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH培养箱中孵育24h；（9）收获细胞：用浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液将细胞从步骤（8）孵育后的6孔细胞培养板的孔内分别消化下来，得到细胞悬浮液；（10）低渗：将步骤（9）的细胞悬浮液进行离心分离，移除上清液后加入浓度为0.075mol/L的氯化钾溶液3mL并吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇/冰醋酸溶液2mL，再进行离心分离，移除上清液；（11）滴片：将步骤（10）中所得上清液用于吹打细胞，形成细胞悬浮液，再将细胞悬浮液滴在载玻片上自然晾干；（12）染色：将步骤（11）晾干后的载玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后，再用自来水冲洗载玻片并自然晾干后保存备用；（13）微核计数：挑选步骤（12）的载玻片，至少观察1000个双核细胞，并计数微核率；（14）结果判定：将待测样品组的微核率与阴性对照组的相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系的，即可确认为阳性结果。