一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用。采用本发明的制备方法制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶具有高的酶活力，重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为27800BAEE单位/mg酶；重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为30200BAEE单位/mg酶；商品化猪胰蛋白酶的酶活力为9600BAEE单位/mg酶。本发明的制备方法具有酶产量高、特异性好、无动物来源病毒等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。

主权项

制备胰蛋白酶的方法，包括向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的胰蛋白酶原的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包涵体；对所述包涵体进行变性，得到变性后的样品；将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；将所述复性后的样品进行第一次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶原；将所述纯化后的胰蛋白酶原进行激活，得到激活的胰蛋白酶；将所述激活的胰蛋白酶进行第二次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶；所述复性在复性缓冲液中进行，所述复性缓冲液的pH值为7.0‑9.0，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为10‑50mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为1‑2M，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为1‑2mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3‑5mM；所述第一次纯化为将所述复性后的样品进行阳离子交换柱层析，收集所述胰蛋白酶原的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是磺丙基，所采用的洗脱程序为NaCl线性梯度洗脱，所述NaCl线性梯度洗脱采用NaCl线性梯度洗脱液进行洗脱，所述NaCl线性梯度洗脱液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成，所述溶质为NaCl，所述溶剂为pH值为4.6，醋酸根离子浓度为10‑50mM的醋酸‑醋酸钠缓冲液；所述NaCl线性梯度洗脱的时间是48min，所述NaCl线性梯度洗脱中NaCl的浓度在48min内由0.025M匀速升至0.4M；所述激活在激活缓冲液中进行，所述激活缓冲液的pH值为7.5‑8.5，所述激活缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油；所述三羟甲基氨基甲烷在所述激活缓冲液中的浓度为10‑50mM，所述氯化钠在所述激活缓冲液中的浓度为0.1‑0.3M，所述氯化钙在所述激活缓冲液中的浓度为1‑20mM，所述甘油在所述激活缓冲液中的体积百分比浓度为5‑15％；所述第二次纯化为将所述激活的胰蛋白酶进行凝胶过滤层析，收集所述激活的胰蛋白酶的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围为10‑600kD，所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内径比为36：1，所述凝胶过滤层析所采用的洗脱剂是凝胶过滤层析洗脱液，所述凝胶过滤层析洗脱液的pH值为7.5‑8.5，所述凝胶过滤层析洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和氯化钙；所述三羟甲基氨基甲烷在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为10‑50mM，所述氯化钙在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为1‑20mM。