GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。本发明所述的双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接GM-CSF基因和MART-1基因，能够在同一载体中同时表达人黑色素瘤分化抗原和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子，该重组载体可用于黑色素瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对黑色素瘤产生特异性抗肿瘤效应。

主权项

GM‑CSF和MART‑1双基因共表达重组载体的制备方法，所述的GM‑CSF和MART‑1双基因共表达重组载体沿载体转录方向依次连接有GM‑CSF基因、IRES序列和MART‑1基因，所述GM‑CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART‑1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；所述的载体为pIRES2‑EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2‑GM‑CSF‑MART‑1重组载体，GM‑CSF基因位于IRES序列的上游，MART‑1基因位于IRES序列的下游；其包括以下步骤：A)获得含有特异性酶切位点的GM‑CSF基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位点序列的GM‑CSF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位点的GM‑CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；B)构建pIRES2‑GM‑CSF‑EGFP重组载体：用限制性内切酶EcoR I、BamH I分别酶切pIRES2‑EGFP质粒以及步骤A)得到的GM‑CSF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2‑GM‑CSF‑EGFP重组载体；C)获得含有酶切粘性末端的MART‑1基因片段：从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART‑1特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到MART‑1基因片段混合物，其中的一种MART‑1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；D)构建pIRES2‑GM‑CSF‑MART‑1重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤B)得到的pIRES2‑GM‑CSF‑EGFP重组载体，将步骤C)得到的MART‑1基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2‑GM‑CSF‑EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2‑GM‑CSF‑MART‑1重组载体；其中，步骤A)所述的GM‑CSF特异性引物为：GM‑CSF上游引物：5’‑CGGAATTCATGTGGCTGCAGA‑3’，GM‑CSF下游引物：5’‑TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT‑3’；步骤A)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环，72℃最终延伸5min；步骤C)所述的MART‑1特异性引物包括MART‑1第一引物对和MART‑1第二引物对，所述的MART‑1第一引物对由MART‑1上游长引物和MART‑1下游长引物组成，所述的MART‑1第二引物对由MART‑1上游短引物和MART‑1下游短引物组成：MART‑1第一引物对为：MART‑1上游长引物：5'‑AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT‑3'，MART‑1下游长引物：5'‑GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG‑3'；MART‑1第二引物对为：MART‑1上游短引物：5'‑ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC‑3'，MART‑1下游短引物：5'‑GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC‑3'；步骤C)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环，72℃最终延伸5min；步骤C)所述杂交PCR反应的反应条件为：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，40℃1min，4℃保存。