猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法，通过全基因合成带有接头的猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因，将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，电穿孔转化长双歧杆菌(B.longum)，构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗，为猪囊尾蚴病的防治提供一种有价值的新型疫苗。

主权项

一种猪带绦虫TSO45W‑4B‑TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)TSO45W‑4B‑TSOL18融合基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSO45W‑4B和TSOL18基因序列，将TSO45W‑4B和TSOL18基因片段用甘氨酸接头(Gly4Ser)3 linker连接，通过全基因合成的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端分别加入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点和保护性碱基，合成长度为789bp的TSO45W‑4B‑TSOL18融合基因；(2)重组质粒pGEX‑TSO45W‑4B‑TSOL18的构建及鉴定：合成基因的PCR产物与克隆载体pMD18‑T在T4DNA连接酶作用下，连接，连接产物转化至E.coli Top10感受态细胞，冰浴，水浴，冰浴冷却后加入LB培养液，振摇，离心，弃上清，剩余200μl混匀涂于含Amp的LB琼脂平板上，倒置培养12～16h；挑取单菌落至含氨苄青霉素的LB培养液中，振摇培养，提取质粒，进行PCR鉴定；然后将重组质粒pMD18‑T‑TSO45W‑4B‑TSOL18与表达载体pGEX‑1λT分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，胶回收相应片段后用T4DNA连接酶16℃连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定；(3)猪带绦虫重组Bb(pGEX‑TSO45W‑4B‑TSOL18)疫苗的构建及鉴定①B.longum感受态细菌的制备：将B.longum冻干粉用无菌水充分溶解后，涂布于MRS琼脂平板上，厌氧培养24～72h，使其充分活化；挑取活化的单菌落，接种于MRS液体培养中厌氧培养；然后按1:25比例接种于含蔗糖的MRS培养基中，厌氧培养24～72h；冰浴，离心，弃上清，沉淀用预冷的蔗糖清洗，再用蔗糖缓冲液重悬；此细菌可立即用于电转化，或者加入预冷的甘油，‑80℃冻存备用；②重组质粒pGEX‑TSO45W‑4B‑TSOL18电转化B.longum感受态细菌：取备用的重组质粒pGEX‑TSO45W‑4B‑TSOL18与B.longum感受态细菌混匀，冰浴10～15min后转移至电击杯中，电击完毕后立即将混合液转入到MRS液体培养基的EP管中，厌氧培养；将菌液涂布于含氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，厌氧培养24～72h；③猪带绦虫重组Bb(pGEX‑TSO45W‑4B‑TSOL18)疫苗的鉴定：挑取上述平板中单个菌落至含氨苄青霉素的MRS培养基的EP管中，厌氧培养24～72h；将菌液离心，弃上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌体沉淀，温浴，期间振荡使其充分反应；抽提质粒，进行酶切、PCR和测序鉴定；步骤②中所述的电击参数设置为：电压1.25KV、场强12.5KV/cm、电容25μF、电阻200Ω、转化时间5ms。