一种转基因胰岛素的合成工艺

摘要

本发明公开了一种转基因胰岛素的合成工艺，其工艺步骤为：(1)提取目的基因；(2)培养工程菌；(3)提取质粒；35℃培养平板中挑取一个单菌落(直径2～3mm)，接种到10ml LB培养液35℃剧烈振摇培养16h，取4ml菌液到5ml离心管，8000rpm室温离心3min，去上清，放于面巾纸上吸干痕液，加350ul RNaseA的溶液，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次，将上清倒入柱状收集管中，将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min洗提质粒；(4)基因重组；(5)感受态细胞的制备；(6)导入载体；(7)分离纯化；(8)基因表达，本发明的胰岛素能够在短时间内大量生产，产品为基因产物，纯度高，药效好，发酵化生产，易于控制，稳定性好，适于推广应用。

主权项

一种转基因胰岛素的合成工艺，其特征在于，其工艺步骤如下：(1)提取目的基因：向牛肉膏蛋白胨培养基中加入适量血清，接种培养人体胰岛B细胞，控制培养温度为35℃，PH为7.0，用限制性内切酶获取胰岛B细胞内的产胰岛素的核苷酸序列，提取目的基因，备用；(2)培养工程菌：选用大肠杆菌作为工程菌，用肉汁培养基培养，接种与摇瓶培养基中，于35℃下振摇培养24h，调pH至5.0，而后放入恒温箱中培养，培养温度为35℃；(3)提取质粒：35℃培养平板中挑取一个直径2～3mm的单菌落，接种到10ml LB培养液35℃剧烈振摇培养16h，取4ml菌液到5ml离心管，8000rpm室温离心3min，去上清，放于面巾纸上吸干痕液，加350ul RNaseA的溶液，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次，将上清倒入柱状收集管中，将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min洗提质粒；(4)基因重组：运用同种限制性内切酶切割步骤(3)提取的质粒的基因序列，再经过DNA聚合酶将步骤(1)提取的目的基因导入质粒基因中；(5)感受态细胞的制备：将步骤(2)某一菌落置于－70℃温度下培养，而后用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于35℃培养过夜，第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，35℃振荡培养过夜，次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，350C剧烈震荡培养约2‑3小时，当菌落600nm OD值达到0.4‑0.5时，将烧瓶取出放置冰水上10‑15分钟，在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中，4℃，8000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟，4℃，8000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液，加2ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体，每管0.1ml分装，至4℃保存备用；(6)导入载体：将步骤(4)载有重组基因的质粒导入步骤(5)制得的感受态细胞中，在大肠杆菌细胞施加高压，以使导入顺利进行；(7)分离纯化：在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(6)得到的大肠杆菌，提取标记基因表达的菌落，将其接种到另一培养基中纯化培养；(8)基因表达：经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为35℃，从发酵罐流出液中即可提取，得到胰岛素。