一种合成匹诺塞林的方法

摘要

本发明涉及一种合成匹诺塞林的方法，公开了菌株的构建方法与高效合成匹诺塞林的新途径，并对其发酵方式进行了底物浓度和诱导时间的优化，证实该菌能以L-苯丙氨酸和葡萄糖为底物，高效合成类黄酮化合物,特别是以0.03M葡萄糖和3 mM L-苯丙氨酸为底物，经本发明方法中所构建的菌株CY003发酵合成匹诺塞林，高达27.76 mg/L，是菌株CY001产量的近39倍，同时丙二酰辅酶A是菌株CY001产的近2倍。

主权项

一种合成匹诺塞林的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）把苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4香豆酸一辅酶A连接酶（4CL）、查耳酮合成酶(CHS)和查耳酮异构酶(CHI)亚克隆至载体pET‑28a，构建得到4个表达不同基因的的表达质粒pET‑PAL、pET‑4CL、pET‑CHS和pET‑CHI ；（2）纯化扩增出步骤（1）所得的各个质粒上的T7元件，分别为PAL‑T7 terminator、T7 promoter‑4CL‑T7 terminator、T7 promoter‑CHS‑T7 terminator和 T7 promoter‑CHI片段，连接至平末端载体pMD‑19T simple，构建得到克隆载体pMD‑PAL‑T7、pMD‑T7‑4CL‑T7、pMD‑T7‑CHS‑T7和pMD‑T7‑CHI；（3）分别用BamHI和SphI，SphI和SpeI，SpeI和PstI，PstI和EcoRI，BamHI和PstI酶切步骤（2）所得的4个克隆载体和步骤（1）所述的表达质粒pET‑28a，凝胶纯化试剂盒回收pMD质粒相应的小片段；T4连接酶用于连接各个片段，而后转化至感受态菌株Trans‑T1，获得阳性转化子；   （4）从步骤（3）得到的阳性转化子中提取目的质粒pET‑4GS，并将该质粒转化至感受态菌株BL21（DE3）；获得阳性转化子菌株，命名为大肠埃希氏菌 CY001；   （5）利用所得菌株发酵诱导合成匹诺塞林。