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一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)对目标蛋白进行特异性肽段筛选，采用蛋白酶对目标蛋白进行理论酶切，得到各条理论酶切肽段；将得到的理论酶切肽段逐条利用Blast工具检索，确定出目标蛋白的特异性酶切肽段；(2)通过化学合成的方法采用氨基酸合成出特异性肽段；采用同位素标记的氨基酸合成出同位素标记的特异性肽段，通过反相高效液相色谱法对合成的肽段进行纯化得到纯品，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出合成肽段中目标肽段的质量分数P<sub>peptide</sub>；(3)获得待测目标蛋白的纯品，并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出蛋白质纯品中蛋白质的质量分数P<sub>protein</sub>；称取蛋白纯品，配制成标准蛋白母液，计算其浓度；(4)对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定，得到样品中目标蛋白的粗测浓度c<sub>1</sub>；(5)对样品中的蛋白进行酶切，根据目标蛋白的粗测浓度c<sub>1</sub>，添加适量的同位素标记特异性肽段，并以合成的非标记特异性肽段为标准，采用同位素稀释质谱法对样品酶解液中特异性肽段浓度进行测定，浓度测定结果为c<sub>peptide</sub>；(6)根据粗测浓度c<sub>1</sub>，在质量为w<sub>0</sub>的样品中添加浓度为c<sub>0</sub>或其稀释液的待测目标蛋白溶液w<sub>1</sub>，使其浓度略有增加，添加后的浓度与添加前的浓度处于同一个数量级；接着按照步骤(4)对添加后的样品进行酶切和特异性肽段浓度的同位素稀释质谱测定，测定结果为c<sub>pept</sub><sup>id</sup><sub>e</sub>1；(7)根据测定的酶解液中特异性肽段的浓度，计算蛋白浓度；(8)计算添加目标蛋白为w<sub>1</sub>时的酶切效率；(9)重复步骤(6)到步骤(8)的过程，每次添加不同的蛋白量，得到一系列的酶切效率值η<sub>n</sub>；(10)以蛋白添加质量浓度为横轴、酶切效率为纵轴作图，通过拟合得到酶切效率与蛋白添加量的关系图，将蛋白添加量外推至0，得到原始样品中蛋白质的准确酶切效率。 |
