一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法

摘要

本发明公开的一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，包括如下步骤，（1）以棘孢木霉菌质量浓度对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读取出的CT值为Y轴，绘制标准曲线；（2）将待测棘孢木霉菌接种于土壤中，接种后从土壤中提取出待测DNA并纯化；（3）用荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp的产物时，记录此时待测DNA的CT值，将该CT值带入标准曲线中，得到待测棘孢木霉的质量浓度对数值，根据公式计算出棘孢木霉菌在土壤中的定殖量。本发明的优点在于，摸索出棘孢木霉与其它木霉异源性的特异性区域DNA，能够准确地单一检测出棘孢木霉的量，采用的荧光定量PCR扩增方法，棘孢木霉菌在每个质量浓度下都有相对应的CT值，检测结果准确。

主权项

一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:(1)以棘孢木霉菌质量浓度对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读取出的CT值为Y轴，绘制质量浓度对数与CT值的标准曲线：①采用荧光定量PCR扩增方法将棘孢木霉特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp时，即得到棘孢木霉特异区DNA；②将棘孢木霉特异区DNA插入到感受态大肠杆菌载体pMD^TM20‑T vector后，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，氨苄青霉素在LB培养基中的质量浓度为1μl/ml，培养24h后，采用质粒试剂盒制备棘孢木霉菌特异区DNA质粒；③将②步制备好的棘孢木霉菌质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度为2.8×10³ng/mL，然后用灭菌后的去离子水逐级稀释10倍，得到母液逐级稀释液；④经③步得到的逐级稀释液，采用荧光定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出126bp产物时，记录该CT值，以每级稀释液质量浓度对数值为X轴，CT值为Y轴，即绘制出质量浓度对数与CT值的标准曲线；(2)将待测棘孢木霉菌接种于土壤中，接种后从土壤中提取出待测DNA并纯化；(3)采用荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp的产物时，记录此时待测DNA的CT值，将该CT值带入到步骤(1)绘制出的标准曲线当中，得到待测棘孢木霉的质量浓度对数值，根据如下公式计算出棘孢木霉菌在土壤中的定殖量；步骤(1)和步骤(3)荧光定量PCR扩增方法所用的试剂包括12.5μl的SYBR Premix Ex Taq、质量浓度均为10μmol/L的正向引物、反向引物各1μl、1μl的棘孢木霉特异区DNA质粒溶液/待测棘孢木霉菌DNA溶液、超纯水补至25μl；以及所述荧光定量PCR扩增方法采用的正向引物为5‘‑CCAAACTCTTTCTGTAGTCCCC‑3’，反向引物为5‘‑GCATTTCGCTGCGTTCTT‑3’。