基因表达盒及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种基因表达盒，其包括依次连接的神经元特异性启动子、目的基因、γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列以及终止子。该基因表达盒目的基因的末端添加有γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列，由于γ-氨基丁酸能神经元中含有其特异性的miRNA，该miRNA会导致基因表达盒在γ-氨基丁酸能神经元中沉默，目的基因不能表达，而五羟色胺能神经元中则不含有该miRNA，不会受基因沉默的影响，可正常表达目的基因，特异性强。同时，采用整个神经元的特异性启动子，在神经元中启动目的基因的表达效率高。利用上述基因表达盒构建的重组表达载体或者基因表达盒本身可广泛应用在五羟色胺能神经元相关的神经环路研究领域。

主权项

一种基因表达盒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：合成miRNA448的靶序列，并在所述靶序列的两端分别连接上Bgl II和EcoR I基因序列，然后将合成好的含有Bgl II和EcoR I基因序列的所述靶序列连接到pCMV‑MCS载体上，经酶切鉴定得到pCMV‑MCS‑靶序列的基因序列，其中，所述miRNA448的靶序列为序列表中SEQ ID NO.2的序列；使用Not I酶切所述pCMV‑MCS‑靶序列的基因序列，并使用Kpn I酶切构建好的SYN‑ChR2‑YFP基因序列，分别对两种酶切产物进行纯化并将两种酶切产物的末端补平，再使用EcoR I酶切酶分别对两种补平的酶切产物进行酶切，回收并纯化酶切产物，其中，所述SYN‑ChR2‑YFP基因序列为依次连接的神经元特异性启动子、光敏感通道蛋白基因以及黄色荧光蛋白基因，所述神经元特异性启动子的序列为序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；连接上步骤得到的两种酶切产物，并在靶序列的末端加上终止子，得到结构为SYN‑ChR2‑YFP‑靶序列‑终止子的基因表达盒。