一种马铃薯病毒的快速灵敏检测方法

摘要

本发明公开了一种云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种病毒的检测方法。本发明通过对云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种特异性混合抗体诱捕病样中病毒，不必提取样品总RNA进行随机引物逆转录和特异性病毒引物复合PCR反应。本方法将快速、特异的免疫沉淀与灵敏的复合RT-PCR结合，同时设置健康马铃薯随机引物cDNA产物和相应病毒PCR特异片段阳性质粒作为阴、阳性对照，从而快速、准确、灵敏的应用于检测田间马铃薯植株样品、抗病毒材料及田间环境疑似侵染源等方面。

主权项

一种快速灵敏检测马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒的方法，其特征在于包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括：A、前处理：待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心取上清液备用；所述DEPC处理的PBST溶液是在含有0.01%吐温20的0.1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入0.2%DEPC充分混匀后，放置过夜，高压灭菌30min；根据GenBank序列数据库中马铃薯病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对的相互影响，筛选用于复合PCR的不同马铃薯病毒检测引物对；马铃薯病毒引物对为：；在PCR管中加入终浓度分别为1:5000、1:5000、1:5000和1:5000的马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒多抗稀释液100μl，3~5℃包被过夜或36~38℃包被0.5~1.5h后，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR内壁2~5次，吸进管中液体，PCR管待用；取上清液50μl加入上述PCR管中，36~38℃放置0.5~1.5h以捕捉或沉淀对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤1~2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3~5℃放置待用；B、PCR反应：在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用马铃薯病毒引物对进行复合PCR反应；PCR反应体系为50μL体系，其中10倍Taq酶缓冲液5μL、10mmol/L 浓度的8种引物各1μL、2.5mmol/L dNTPs 3μL、Taq酶1μL、灭菌超纯水15μL；反应条件为94℃预变性4min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10 min；经复合PCR反应，马铃薯Y病毒扩增出690bp的目的片段、马铃薯S病毒扩增出385bp的目的片段、马铃薯A病毒扩增出870bp的目的片段、马铃薯卷叶病毒扩增出210bp的目的片段；C、电泳检测：取PCR反应液5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据样品中目的片段的大小差异快速确定样品中病毒种类及数量。