周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒。根据测序结果分析，推测其氨基酸序列，然后利用相关的软件预测它们的B细胞表位和T细胞表位，制备出周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因疫苗。将该疫苗免疫接种BALB/c小鼠，并检测其疫苗的体液免疫和细胞免疫的应答效果。试验结果证明了该疫苗可诱导小鼠产生特异性的免疫应答反应，取得满意效果，制备周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因疫苗获得成功。

主权项

一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，其特征是： 包括下列步骤： (一)引物设计 根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因(的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入Xho Ⅰ/BamH Ⅰ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基； P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’ 下划线序列为BamH Ⅰ酶切位点  Tm＝56.84 P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’ 下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点  Tm＝66.90 (二)周期型马来丝虫虫体及微丝蚴的收集和总RNA的提取和测定 (1)将取自长爪沙鼠腹腔液的成虫及微丝蚴移入1.5ml匀浆器中,加入1mlTrizol试剂研磨,室温静置5min； (2)加入0.2ml氯仿,震荡15s后静置2min,4℃,12000rpm离心15min取上清； (3)加入0.5ml异丙醇混匀,室温静置10min,4℃,12000rpm离心10min弃上清； (4)加入1ml 75％乙醇混匀,4℃,9000rpm离心5min弃上清； (5)干燥5min后溶于DEPC处理水30ul,60℃ 10min； (6)取2ul总RNA稀释200倍,在紫外分光光度计上测OD260和OD280值,确定其浓度和纯度,并进行甲醛电泳检测； (三)cDNA的合成 (1)取总RNA 5ul,后加入10mM dNTPmix 1ul,0.5ug/ul oligo(dT)12‐18ul,DEPC处理水3ul,65℃加热5min,后冰浴5min； (2)另取10×Buffer 2ul,25mM MgCl2 4ul,0.1M DTT 2ul,RNA酶抑制剂1ul混匀,42℃孵育2min； (3)将步骤(2)混合液加入步骤(1)物质中混匀,再加入1ul逆转录酶SuperscriptⅡ混匀；42℃孵育50min,70℃15min终止反应,‐70℃保存备用； (四)PCR扩增Bm‐myosin基因 P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM  dNTPmix 4.0ul,P1 P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；混匀在DNA扩增仪PTC‐100上进行PCR；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定； (五)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化 (1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物； (2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5ml Eppendorf管4℃离,8 000rpm 5min；弃上清,加入冰浴0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm 5min,弃上清,加入冰浴0.1mol/L CaCl₂‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用； (3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h； (4).转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min。将培养物100ul涂在含有X‐gal,IPTG,Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养； (六)阳性重组克隆的筛选和鉴定 (1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒； (2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1、P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1、P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定； (3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamH Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段； (七)Bm‐MYOSIN二级结构预测 分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredic、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构； (八)Bm‑MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测 采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测； (九)Bm‐MYOSIN T细胞表位预测 (1)人源HLA Ⅰ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLA Ⅰ类分子结合肽，保留输出的结果； (2)鼠源MHC Ⅰ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d，包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHC Ⅰ类分子；预测MHC Ⅰ类分子结合肽，保留输出的结果； (3)人源HLA Ⅱ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301、HLA‐DRB1*1501，预测HLAⅡ类分子结合肽，保留输出的结果； (4)鼠源MHCⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHCⅡ类分子结合肽，保留输出的结果； (十)表位基因片段的选择 根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp‐1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29。应用Primer 5软件设计引物； 上游P1：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’ 其中GGATCC为BamH Ⅰ酶切位点； 下游P2：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT 其中GAATTC为EcoR Ⅰ酶切位点； 引物使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L； (十一)表位基因片段PCR扩增 (1)以pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系： PCR扩增反应体系 扩增反应参数为： 取5μl样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因； (十二)目的基因与载体连接与鉴定 A、PCR产物及pET‐28a(+)载体质粒双酶切体系： 双酶切反应体系 目的基因与载体连接，具体反应体系: 目的基因与载体连接反应体系 混匀，室温反应30min以上，产物用于转化； B、E.coli DH5α感受态细胞的制备 (1)用接种环取保存于‐80℃DH5α菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养约14‐16h至单菌落出现； (2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37℃振荡培养约10‐12h； (3)取1ml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37℃振荡培养约2‐2.5h，到OD值达0.5，冰浴5‐10min； (4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4℃，1600rpm离心7min； (5)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，4℃，1100rpm离心5min； (6)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4℃，1100rpm离心5min； (7)用2ml冰冷的0.1M CaCl₂溶液重悬细胞，分装后15％甘油冻存于‐80℃； C、转化及鉴定 (1)取100μl贮存于‐80℃钙化菌，冰浴化开；加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min； (2)热休克，42℃水浴30‐90s，勿动； (3)快速转移到冰浴中，冷却1‐2min； (4)加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37℃，100rpm振荡培养45min； (5)5000rpm离心1min； (6)弃部分上清，混匀后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体被吸收，37℃温箱倒置培养12‐16h； (7)用白枪头挑单克隆至5ml含Amp的LB液，37℃，220rpm振荡培养12‐16h，至OD值在0.6‐0.8之间； (8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应； (9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定； (10)选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后进行测序； (十三)BmM29表位基因真核表达载体构建 纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的克隆位点。目的基因和载体的摩尔比为5:1,反应体系25ul,16℃水浴连接过夜；取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于LB‐Amp平板上,其中每mlLB中含Amp100mg，37℃过夜培养；从LB‐Amp平板上随机挑取单个菌落,分别接种于LB‐Amp培养基中,37℃振荡过夜培养,提取重组质粒,经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切,后1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定； (十四)BmM29表位基因疫苗免疫应答试验 A.pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)‐BmM29质粒大量抽提 (1)取100ml过夜培养的菌液加入50ml离心管，12000rpm离心3min收集细菌，尽量弃尽上清； (2)12000rpm离心3min，用移液器把剩下的少量液体吸出； (3)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液1，使用涡旋振荡器和移液器让细胞悬浮，无小菌块； (4)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液2，立即温和地上下翻转6‐8次，室温静置5min； (5)加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液4，立即温和地上下翻转6‐8次，室温静置10min，12000rpm离心20min，将溶液全部倒入过滤柱中，慢慢推动推柄，滤液收集在50ml离心管中； (6)向滤液中加8ml异丙醇，混匀后转移到吸附柱，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液； (7)向吸附柱中加3ml去内毒素缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液； (8)向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液。重复一次； (9)将吸附柱重新放回收集管，12000rpm离心5min，去除吸附柱中残余的液体。 (10)吸附柱置于干净的50ml收集管，加1ml洗脱液TE，室温静置5min，12000rpm离心2min； (11)用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为1mg/ml，‐20℃保存备用。