金龟子绿僵菌突变株及其在甾体化合物羟化反应中的应用

摘要

本发明属微生物及化学合成领域，具体涉及一株金龟子绿僵菌突变株Metarhizium anisopliae11490及其在甾体化合物羟化反应中的应用，所述的金龟子绿僵菌突变株于2011年7月7日保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2011240。采用所述的突变株进行羟化反应，包括斜面培养，种子培养，扩大培养，甾体转化，产物分离等步骤。该突变株能在甾体化合物19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮上有效的引入11α羟基，具有广泛的甾体底物选择性。本发明的方法具有转化率高、无污染、培养方法简单易操作的优点，能为甾体药物合成提供关键中间体，具有很大的应用前景。

主权项

一种基于金龟子绿僵菌突变株的甾体化合物11α羟化反应方法，其特征在于：采用所述的金龟子绿僵菌突变株在甾体化合物上引入11α羟基，其包括步骤：(1)选择菌种：金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490，所述金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490，保藏号为CCTCC M2011240，保藏日期为2011年7月7日；(2)斜面培养：将所述菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，其中添加质量百分比为0.25％的蚕蛹粉，26～30℃培养5～10天；(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有40mL液体培养基的250mL摇瓶中，26～30℃条件下，旋转式摇床220r/min培养24～60小时，制得种子液，所述的培养基中，含质量百分比1～3％的葡萄糖、1～3％的黄豆粉、0.25～1％的蚕蛹粉，pH6.0～7.0；(4)扩大培养：以5～15％的体积比的接种量将种子液接种于步骤(3)所述的液体培养基中，26～30℃条件下，旋转式摇床220r/min培养24～60小时，得发酵液；(5)甾体转化：将待转化的甾体底物预先溶于含质量百分比为1％的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比1～3％的投料量投入经步骤(4)培养获得好的发酵液中，26～30℃条件下，旋转式摇床220r/min转化48～96小时，得发酵液；(6)分离产物：将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的甾体底物11α羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化甾体底物。