一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法，具体步骤为：（1）设计引物和探针；（2）提取待测淀粉样品的DNA模板；（3）测定提取DNA的质量浓度；（4）两对对特异性引物以及相对应荧光探针进行实时荧光PCR扩增；（5）PCR扩增产物的检测，根据每个循环结束记录荧光信号的数据，反应结束后根据数据绘制扩增曲线，最后判断特异性和灵敏性。本发明的检测方法准确性高、反应灵敏、特异性高，可以快速检测淀粉样品中是否含荸荠和马蹄成分，较之传统方法，提高木薯淀粉和荸荠淀粉鉴定的客观性和准确度，适合快速鉴定木薯淀粉和荸荠淀粉使用。

主权项

一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法，包括DNA提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征是：具体步骤如下：（1）提取DNA：A、分别秤取等重均匀的荸荠淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、莲藕淀粉、马铃薯淀粉和甘薯淀粉200mg置于Axygen 1.5ml的离心管中，加入65℃预热的改良CTAB提取缓冲液700ul，充分振荡混匀，65℃温育3h，每隔半30min颠倒混匀一次；B、取出离心管，待冷至25℃后，加入700ul酚与氯仿配比＝1:1的混合溶液上下颠倒充分混合5分钟，以12000 rpm 离心10分钟取上清，然后再重复此步骤一次；C、用剪去头部的200μl 枪头将上清液转移到另一个新的离心管中，加入浓度为10mg/ml的 RNaseA2μl；D、加入体积为700μl的氯仿，上下颠倒充分混合，5分钟，后抽提；E、室温下，以12000 rpm 离心10分钟，吸取将上清液转移到另一新的离心管中；F、加入体积为700μl的异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟后可见沉淀，待完全沉淀后完全，在‑20℃放置1‑2小时；G、室温下，12000 rpm 离心10分钟，沉淀积于管底，弃尽倒去上清液；H、加入700μl 体积百分含量为70%的乙醇清洗30分钟；I、倒去离心管中的乙醇，使DNA沉淀在管中自然晾干；J、加入100ulddH₂O溶解，放入‑20℃冰箱保存备用；（2）DNA的质量浓度测定：取5ul提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量，另再取1‑2ul提取的DNA溶液利用微量紫外分光光度计测定所提取的DNA的精确浓度和纯度；（3）PCR检测体系建立：实时荧光PCR反应体系为总体积25μl，内含淀粉DNA样品2μl，Mix 12.5μl，特异引物终浓度0.2μmol/L，探针引物终浓度为0.1μmol/L，用ddH₂O补充到25μl，在一定的反应条件下进行实时荧光PCR反应；（4）PCR扩增产物的检测：对荸荠淀粉、木薯淀粉两对引物以及Tagman探针扩增产物特异性和灵敏性检测。