诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法

摘要

本发明公开了一种诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法。保持H9细胞以细胞团状态传代，而且细胞团大小均一，能保持其细胞团高密度培养；在此基础上引入SB431542和NOGGIN两种诱导因子，利用化学成分确定的knock out serum replacer(KSR)培养基和N2培养基，在培养不同时间按不同比例配合使用上述培养基；在诱导分化后期的在N2培养基内添加抗坏血酸(维生素C)，在较短的时间内即可诱导HESC定向分化形成表达PAX6蛋白的NE细胞。

主权项

一种诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法，其特征在于，步骤包括：制备KSR培养基，上述KSR培养基包括：以DMEM/F12作为溶剂、体积比在15‑25％的knockout serum replacer、浓度在8‑12ng/ml的FGF‑2、0.08‑0.12mM的beta‑mercaptoethanol、体积比在0.8‑1.2％的Non‑essential amino acid；制备N2培养基，上述N2培养基包括：以DMEM/F12作为溶剂、体积比在0.8‑1.2％的N2supplement、8‑12ng/ml的FGF2、0.08‑0.12mM的beta‑mercaptoethanol、体积比在0.8‑1.2％的Non‑essential amino acid；人胚胎干细胞H9细胞系接种于细胞培养板，用mTeSR^TM1培养基培养，每天换液一次；待胞培养板中人胚胎干细胞H9细胞达到80％融合时，按照1：4比例传代；上述80％融合的人胚胎干细胞H9细胞，使用Accutase消化20分钟，消化进行中在mTeSR^TM1培养基中加入ROCK‑inhibitor，然后用含ROCK‑inhibitor的mTeSR^TM1终止消化，制备成人胚胎干细胞悬液，在显微镜下用细胞计数板计数；然后经150rpm离心15分钟,弃去上清，以10ml移液管吸取含ROCK‑inhibitor的mTeSR^TM1培养基重悬细胞，缓慢轻柔吹打细胞数次，确保细胞悬液中形成小的细胞团，不形成单个细胞悬液；然后分别按照04X10⁴cells/cm²、0.8X10⁴cells/cm²和2X10⁴cells/cm²传代在细胞培养板内；隔天用新的不含ROCK‑inhibitor的mTeSR^TM1培养基替换旧培养基，继续培养人胚胎干细胞至95％融合；将上述KSR培养基和上述N2培养基的按照4：0、3：1、2：2、1：3、0：4的比例分别孵育上述95％融合的人胚胎干细胞，在诱导分化前5天在上述KSR培养基和上述N2培养基内均添8‑12μM的SB431542和450‑550ng/ml的NOGGIN；诱导分化的第6天开始在N2培养基中添加0.18‑0.22mM的Ascorbic acid，用含0.18‑0.22mM的N2培养基诱导培养基继续培养至11天，每2天换液一次。