一种磷脂酶Dα活性的测定方法

摘要

本发明提供了一种磷脂酶Dα活性的测定方法，是使用酶联比色法测定磷脂酶Dα活性的方法。其技术方案是以磷脂酰胆碱为底物，磷脂酶Dα催化水解其末端的磷酸二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的催化作用下生成甜菜碱和H₂O₂，生成的H₂O₂在过氧化物酶催化下将4-氨基安替匹林和重蒸酚氧化成粉红色物质，测定该粉红物质的吸光度值，并根据事先制作的胆碱标准曲线，来确定相应的胆碱含量，并以此推算出磷脂酶Dα的活性。在200ul磷脂酶Dα的反应体系中，蛋白含量和Ca²⁺浓度在10ug和10mM为宜。本发明是一种高效便捷，灵敏度高，危害低，结果稳定，适于同时测定大量样品的磷脂酶Dα活性检测方法。

主权项

一种检测磷脂酶Dα活性的方法，其特征是；具有以下的过程和步骤：A．制作用酶联比色法测得的红色产物的吸光度值与其相应的胆碱含量标准关系曲线；具体步骤是；取50%磷脂酰胆碱水溶液按照梯度系列稀释成11组不同浓度的胆碱水溶液，编号，分别加入显色液0.8mL(含45mmol/L的pH8.0 Tris‑HCL <三羟甲基氨基甲烷‑盐酸混合溶液>、0.8单位胆碱氧化酶、2.4单位HRP <辣根过氧化酶>、0.24mg 4‑ATT <4‑氨基安替匹林>和0.16mg重蒸酚)；30℃反应90min，色泽稳定后加1mL Tris‑HCL（含2g/L Triton X‑100 <聚乙二醇辛基苯基醚>，pH8.0）；用0.22μm孔径滤膜滤去蛋白质，测吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据胆碱的含量与所测得的吸光度值之间的关系绘制标准关系曲线；B． 用酶联比色法检测待测磷脂酶Dα催化水解磷脂酰胆碱一系列反应后产生的红色物质的吸光度值，根据上一步骤制作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲线，确定生成胆碱的含量，以此推算出待测磷脂酶Dα的活性；具体步骤是：取200μl磷脂酶Dα反应系（做三个平行样），其中含终浓度为0.1mmol/L DMG(二甲基戊二酸，pH6.5)，10mmol/L MgCL₂，10mmol/L CaCL₂，5mmol/L亚油酸，10μg PLD粗酶液；最后加入12mmol/L磷脂酰胆碱；封口后30℃保温反应30min，沸水浴10min终止反应；冷却后加入显色液0.8mL(含45mmol/L的pH8.0 Tris‑HCL、0.8单位胆碱氧化酶、2.4单位HRP、0.24mg4‑ATT和0.16mg重蒸酚)，30℃反应90min，色泽稳定后加1mL Tris‑HCL（含2g/L Triton X‑100，pH8.0）；用0.22μm孔径滤膜滤去蛋白质，测吸光度值；根据A步骤制作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲线，确定生成胆碱的含量，以此推算出待测磷脂酶Dα的活性。