无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-AC群脑膜炎球菌联合疫苗

摘要

本发明提供了一种吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-AC群脑膜炎球菌联合疫苗，使其具有安全、有效、可控及一针防多病的特点，并符合2010版《药典》三部“吸附无细胞百白破联合疫苗”“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”及拟定“吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗制造与检定规程”的相关要求，达到了可投入实际应用的效果。

主权项

一种联合疫苗，由以下组分(a)和组分(b)组成：(a)吸附无细胞百白破联合疫苗；(b)b型流感嗜血杆菌‑A、C群脑膜炎球菌联合疫苗；(a)和(b)分别装在分开的容器中；所述的(a)吸附无细胞百白破联合疫苗按以下方法制备的：(1)制备各单价疫苗原液：(I)百日咳菌种工作种子批菌种启开后，接种于改良包‑姜培养基或活性炭半综合培养基，于35～37℃培养不超过72小时，经纯菌检查后收集菌体，混悬于pH7.0～7.4的PBS中，采用终浓度小于0.1％甲醛溶液杀菌，经杀菌检查后，即得百日咳疫苗原液；(II)白喉菌种工作种子批传代至产毒培养基种子管2～3代，再传至产毒培养基培养制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养过程中严格控制杂菌污染，检测培养物滤液，毒素效价不低于150Lf/ml时收获，收获后采用硫酸铵、活性炭二段盐析法精制，精制毒素中加入甲醛溶液置35－37℃进行脱毒，脱毒到期的类毒素即为白喉类毒素；(III)破伤风菌种工作种子批先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉蛋白经加深水解后的培养基作为生产用培养基，采用培养罐液体培养，培养过程应严格控制杂菌污染，检测培养物滤液，毒素效价不低于40Lf/ml时收获毒素，毒素中加入甲醛溶液置35‑37℃进行脱毒，制成类毒素，即为破伤风类毒素；(2)合并及稀释：配制氢氧化铝佐剂，采用三氯化铝加氢氧化钠法，配制成的氢氧化铝原液应为浅蓝色或乳白色胶体悬液，将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀释的氢氧化铝佐剂中，用NaOH调pH值至5.8～7.2，即得到吸附无细胞百白破联合疫苗；所述的(b)b型流感嗜血杆菌‑A、C群脑膜炎球菌联合疫苗是按以下方法制备的：(1)制备各单价疫苗原液：(I)A群脑膜炎球菌结合疫苗原液：A群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养，取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热杀菌，将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀，离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为1mol/L，加入乙醇至终浓度25％，2－8℃静置1－3小时或过夜，离心收集上清，于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖，粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，按1：2容量用冷酚提取，所述的冷酚是将100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液获得，冷酚提取后离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液透析，加入乙醇至终浓度75％～80％，离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6‑已二酰肼反应6‑60分钟后采用超滤或透析的方法除去溴化氰和未衍生的ADH，取样检定合格后，将多糖‑AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺冰浴反应1－4小时，用0.2M的NaCl溶液透析过夜，反应物经Sepharose4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得A群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2～8℃保存；(II)C群脑膜炎球菌结合疫苗原液：C群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养，取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，检查合格后，在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热方法杀菌，将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀，离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为1mol/L，加入乙醇至终浓度25％，2－8℃静置1－3小时或过夜，离心收集上清，于上清液中加入冷却乙醇至终浓度80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖，粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，按1：2容量用冷酚提取，所述冷酚由100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液获得，冷酚提取后离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液透析，加入乙醇至终浓度75％～80％，离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6‑已二酰肼反应6‑60分钟后采用超滤或透析除去溴化氰和未衍生的ADH，取样检定合格后，将多糖‑AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺冰浴反应1－4小时，用0.2M的NaCl溶液透析过夜，反应物经Sepharose4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得C群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2～8℃保存；(III)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养，取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热方法杀菌，将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀，离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25％，2－8℃静置1－3小时或过夜，离心收集上清，于上清液中加入冷却乙醇至终浓度80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖，粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，按1：2容量用冷酚提取，所述冷酚由100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液获得，冷酚提取后离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液透析，加入乙醇至终浓度75％～80％，离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6‑已二酰肼反应6‑60分钟后采用超滤或透析法除去溴化氰和未衍生的ADH，取样检定合格后，将多糖‑AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入一定浓度碳二亚胺冰浴反应一定时间，用0.2M的NaCl溶液透析过夜或超滤，反应物经Sepharose4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2～8℃保存；(2)合并冻干：将A、C群脑膜炎球菌多糖结合原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照多糖重量比1：1：1的比例混匀后，加入甘氨酸分装冻干，即得到b型流感嗜血杆菌‑A、C群脑膜炎球菌联合疫苗；所述的(a)组分和(b)组分混匀后为白色混悬液，无摇之不散的异物，其中，b型流感嗜血杆菌多糖、A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖的含量各不低于10μg；百日咳疫苗效价不低于4.0IU，白喉疫苗效价不低于30IU，破伤风疫苗效价不低于40IU；氯化钠含量为7.5－9.5g/L，氢氧化铝含量为1.0－1.5mg/ml，硫柳汞含量不高于0.1g/L，游离甲醛含量不高于0.2g/L，戊二醛含量小于0.01g/L。