一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法

摘要

本发明公开了一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法。本发明运用分子生物学技术在表达黑曲霉β-甘露聚糖酶的重组菌中转化含分子伴侣蛋白PDI基因编码区的质粒，使β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达。在伴侣蛋白的协同作用下，加速了外源蛋白的合成速率，从而增加了外源蛋白β-甘露聚糖酶的分泌速率。本发明将β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达，提高了β-甘露聚糖酶的表达水平。

主权项

一种共表达伴侣蛋白提高β‑甘露聚糖酶基因表达水平的方法，其特征在于，其步骤如下：(1)黑曲霉β‑甘露聚糖酶基因编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达提取黑曲霉总RNA，将其反转录成cDNA；根据已知的丝状真菌β‑甘露聚糖酶基因编码区序列，设计一对简并引物，设计的引物为：上游引物MAN‑F：5’‑ATGAAG(T/C)T(C/T)TCCA(G/A)C(T/G)CCCTC‑3’，下游引物MAN‑R：5’‑TTA(G/A)GC(G/A)CTA(T/C)(G/C)AATA(T/G)CAGCAAG‑3’；PCR反应体系为50μL：ddH₂O19μL，10μM上下游引物各1μL，模板cDNA4μL，2×Taq PCR MasterMix25μL；PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，52℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min；切胶回收PCR产物并将其克隆至T载体上；对所获得的β‑甘露聚糖酶进行信号肽分析，将β‑甘露聚糖酶成熟肽编码序列克隆至毕赤酵母表达质粒pPIC9K上，构建成pPIC9K‑MAN质粒并实现其在毕赤酵母中的表达，并筛选一株能高表达β‑甘露聚糖酶的重组菌；(2)伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZαA‑PDI质粒的构建将伴侣蛋白PDI基因编码区的序列插入到pPICZαA质粒中，构建成pPICZαA‑PDI质粒；(3)共表达分子伴侣蛋白PDI对β‑甘露聚糖酶产量的影响转化pPICZαA‑PDI质粒到表达β‑甘露聚糖酶的重组菌中，诱导表达β‑甘露聚糖酶，并对其表达条件进行优化，同时鉴定表达产物并分析表达产物的酶学性质。