乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、构建及其应用

摘要

本发明公开了一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、构建及其应用，利用β-酪蛋白启动子启动水牛PRL基因，构建了乳腺特异性表达水牛PRL基因载体，并将该载体转入动物基因组中获得乳腺特异性表达水牛PRL蛋白的转基因动物，其乳汁特异性表达水牛PRL蛋白，且水牛PRL基因的表达可以显著提高乳腺中β酪蛋白以及β-1,4-半乳糖甘转移酶的表达水平。因此，应用本发明可望通过转PRL水牛的制备，获得有大量廉价的PRL蛋白，并提高水牛的产奶量和乳液中的酪蛋白水平，产生巨大的经济效益和社会效益。

主权项

一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤：<1>提取水牛垂体总mRNA，经反转录后，采用特异性引物进行PCR扩增得到全长水牛PRL的cDNA序列，经胶回收纯化PCR产物后，将其TA克隆插入到pMD18T载体中，得到pMD18T‑PRL载体；步骤<1>所述引物为：上游引物5'‑AGCCTAGGACGAGAGCTTC‑3'，下游引物5'‑GGGGTACC GATTTTGACATCGCTACAGAGT‑3'；<2>以步骤<1>中得到的载体为模板，用加有酶切位点和His标签的引物进行PCR扩增，得到水牛PRL基因的CDS片段，并将其TA克隆到pMD18T载体中，得到pMD18T‑PRL/His载体；步骤<2>所述引物为：上游引物5'‑CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGGTTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT‑3'，下游引物5'‑GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT‑3'；<3>以pMD18T为载体骨架，依次酶切连入KpnI‑BCNpolyA‑SacI、BamHI‑PRL/His‑KpnI、SalI‑NotI‑BCN‑BamHI、SalI‑cmv‑EGFP‑SV40polyA‑NotI或KpnI‑BCNpolyA‑SacI、BamHI‑PRL/His‑KpnI、SalI‑NotI‑BCN‑BamHI、SalI‑cmv‑EGFP‑SV40polyA‑NotI、SalI‑EF321‑EGFP‑IRES‑NEO‑SV40polyA‑NotI片段，得到载体一pMD18T‑BCN‑PRL/His‑BCNpolyA‑cmv‑EGFP‑SV40polyA，或载体二pMD18T‑BCN‑PRL/His‑BCNpolyA‑EF321‑EGFP‑IRES‑NEO‑SV40polyA；所述PRL基因为催乳素PRL基因，所述BCN为β‑酪蛋白启动子BCN。