J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡及其应用

摘要

本发明涉及一种J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，包括有衬板，其上设置有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫上包被有胶体金标记的鼠抗鸡IgGFc片段单克隆抗体；硝酸纤维素膜上有包被J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白构成的检测线和兔抗鼠IgG构成的质控线。本发明的优点在于：本发明中J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡检测方法，可快速检测鸡血清中的J亚群禽白血病抗体，从而判断是否感染过J亚群禽白血病。具有反应快速、敏感性高、特异性强、操作简单、适合“栏圈边”检测、经济实惠等优点。

主权项

J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，包括有衬板（2），其上设置有样品垫（5）、金标垫（4）、硝酸纤维素膜（3）和吸水垫（1），其特征在于金标垫上包被有胶体金标记的鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体；硝酸纤维素膜上有包被J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白构成的检测线（7）和兔抗鼠IgG构成的质控线（6）；所述的金标垫上附着有20μl浓度为1.5mg/ml的鼠抗鸡IgG Fc 片段单克隆抗体，其可与鸡血清中特异性抗ALV‑J的抗体结合；所述的金标垫的制备方法如下：取胶体直径为20 ± 5nm的胶体金溶液，用碳酸钠调整至pH8.0，加入鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体，室温搅拌，BSA封闭，离心，弃沉淀；上清液离心，弃上清，将沉淀以与原体积相同的PBS溶解， 如上重复离心2次，所得沉淀物用40%原体积的PBS重悬，即得到金标抗体，将金标抗体均匀分散在玻璃纤维上，使其干燥备用；所述的检测线上的J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白浓度为0.2~0.3μg/ml，体积为10μl， 所述的质控线的兔抗鼠IgG浓度为1.2~2.2 μg/ml，体积为5μl，满足试纸卡检测的灵敏度要求；所述的检测线包被方法如下：取所述浓度0.2~0.3μg/ml的J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白10μl， 在预定的检测线位置划线，干燥后即为检测线；所述的质控线包被方法如下：取所述浓度为1.2~2.2 μg/ml的兔抗鼠IgG 5μl，在预定的质控线位置划线，干燥后即为质控线；所述的鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体的制备方法是：收集规模化蛋鸡场开产前蛋鸡的高免血清采用辛酸－硫酸铵法进行纯化，按每1份血清加4份乙酸钠缓冲液：浓度0.06mol/L，pH值4.0；用浓度1mol/L NaOH调pH值到4.5，加入辛酸33µl/ml，边加边搅拌30min，再2～8℃,12000转/min离心10min，弃沉淀，上清滤纸过滤后用NaOH调pH值至7.4，然后缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度45%，继续搅拌30min，2～8℃静置2h，再2～8℃,12000转/min离心30min，弃上清，用0.01M Tris pH为9.0透析除盐，直至用BaCl₂检测无白色沉淀为止，用PEG8000进行浓缩，利用GE公司AKAT purifier蛋白纯化系统以Hiload 16/60 Superdex 200prep pg凝胶过滤预装柱，纯化粗提的鸡血清IgG，用0.22μm滤器过滤粗提的鸡血清IgG，并经过超声除气；Hiload 16/60 Superdex 200prep pg凝胶过滤预装柱与AKAT purifier蛋白纯化系统相连接，先用ddH₂0清洗柱子，接着用含0.15M NaCl的0.05M pH为8.0磷酸盐缓冲液平衡柱子，流速为2ml/min，直至UV280的吸光值和电导值基线稳定，平衡柱子时要清洗各阀位，将过滤的鸡血清IgG样品用注射器注入样品环中，上样前注意排空注射器里的气泡，以免损害柱子，设置洗脱速度和报警压，进行上样和洗脱，流速为1mL/min，观察UV280值基线的变化，收集紫外吸收峰的洗脱峰，每管收集2ml，SDS‑PAGE电泳检测洗脱蛋白，合并收集液，装入透析袋，放入PEG8000中浓缩，用Nanodrop1000分光光度仪OD280和OD260测吸光值，并根据公式计算IgG含量：蛋白含量mg/mL=(1.45×OD280‑0.74×OD260) ×稀释倍数，测得鸡IgG的蛋白含量为18.6mg/mL，用于鼠抗鸡IgG单克隆抗体的制备，收集纯化后的抗体，纯化的鸡IgG与弗氏佐剂等量混合，充分乳化，以50g～100g/只免疫BALB/c系小鼠3次，每次间隔15～30天，第3次加强免疫后3～4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×10­⁸的脾细胞与2～5×10⁷的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清，在37℃的水浴中将0.7～1ml的40%～50% pH8.5～9.0的PEG4000缓缓加入细胞，温育1min后，缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板，其中100uL/孔，置37℃5%CO₂培养箱中培养，培养7～10天后，用5g～10g/ml的鸡IgG包被96孔酶标板，以ELISA检测杂交瘤的培养上清，挑取OD492=0.8以上强阳性细胞克隆，经连续3次的有限稀释法克隆化，建立杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞腹腔注射经降植烷致敏一周的Balb/c系小鼠，每只小鼠注射5×10­⁵个细胞，诱生小鼠腹水，制备抗IgG Fc片段单克隆抗体，获得的5株杂交瘤细胞株染色体为92～98，其分泌的单克隆抗体特异识别鸡IgG Fc片段，与鸭、鹅、鸽、猪、牛的IgG不反应，亲和力常数达10^‑8，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1，IgG2a。