一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法

摘要

本发明涉及一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，其特征在于：采用以下步骤：（1）表皮形成细胞的分离培养；（2）脂质混合物溶液的配制；（3）聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮。本发明具有以下优点，操作简便，成本低，利于产品的合成和规模生产，产品具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮，方便用于检测化妆品刺激性。

主权项

一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，其特征在于采用以下步骤：（1）表皮形成细胞的分离培养：无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm² , 轧制成0. 5cm×0. 5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0. 125%的DispaseⅡ酶在20℃消化10小时，再加入10ml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37℃消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后, 加入50ml含30‑60U/ml青霉素、30‑50ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养基，摇匀后在37℃培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为1‑5× 10⁵ 个/ml；（2）脂质混合物溶液的配制：称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g，溶于500ml 0.1 mol/L NaOH溶液，加热至70℃，保温30分钟，然后用4‑羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值6.5‑7.0，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1:1‑2混匀，55℃下恒温摇床混合20分钟；（3）聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮：取厚度0.2mm、孔径0.4μm、面积0.64 cm²的聚碳酸酯过滤膜，表面涂覆质量比为10%的IV胶原蛋白水溶液，在37℃烘箱放置1小时干燥后，然后在表面接种步骤1准备的细胞密度为1‑5× 10⁵ 个/ml 的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基，按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的20‑30ml脂质混合物溶液，添加CaCl₂和抗坏血酸，使Ca²⁺ 浓度1.5‑2.0mmol/L，抗坏血酸浓度在50‑60μg/mL，继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.3‑0.6mm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。