一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法

摘要

一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法，属于天然活性物质提取领域。本发明以条斑紫菜为原料，经过烘干、粉碎等预处理后，将原料经过超声波破碎以及硫酸铵沉淀蛋白后，利用木瓜蛋白酶特定条件下酶解紫菜原料得到抑菌肽的粗品，该粗品经过离子交换层析、G-25凝胶层析等色谱方法分离纯化，得到紫菜蛋白抑菌肽。该紫菜蛋白抑菌肽分子量主要分布在1000Da以下，最适作用pH为6.5，热稳定性好；对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有效果，其中对革兰氏阳性菌抑制效果更强，其抑菌效果主要是通过对细胞膜的破坏作用达到的。该紫菜蛋白抑菌肽分子量小，抑菌活性较好，在制备抗菌性药物、食品保鲜剂等领域具有很好的应用前景。

主权项

一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法，其特征在于步骤为：（1）紫菜蛋白的提取和酶解：a、以条斑紫菜为原料，烘干后粉碎，过筛，取60‑80目部分溶于0.02mol/L、pH 7.0的Na₂HPO₄‑KH₂PO₄缓冲液中，溶解时紫菜与缓冲液料液质量体积比为1:25；在冰浴条件下用350 W功率的超声波处理15 min，处理时以工作3 s，间隔3 s为一个循环；将超声处理后的物料以4000 r/min的速度离心15 min，去沉淀，取上清液，添加硫酸铵至60%饱和度，通过盐析提取，离心收集固体物紫菜蛋白；b、将步骤a中硫酸铵盐析得到的紫菜蛋白按湿重计，以紫菜蛋白与缓冲液料液质量体积比为1:10加入pH6.5的Na₂HPO₄‑KH₂PO₄缓冲液，木瓜蛋白酶加入量为4000 U/g湿重计紫菜蛋白，充分混合均匀后65℃酶解4 h，反应过程中保持pH的稳定；酶解结束后，煮沸灭酶15 min，静置冷却后以10000 r/min的速度离心15 min，弃去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液；（2）紫菜蛋白抑菌肽的纯化制备：c、DEAE‑52阴离子交换层析：采用阶段洗脱的方法，流动相：0‑74 min用10mmol/mL的平衡液洗脱，平衡液为pH6.8的Na₂HPO₄‑柠檬酸溶液，74‑120 min用含有0.2mol/mL的NaCl溶液洗脱，120‑200 min用含有0.4mol/mL的NaCl溶液洗脱，200‑250min用含有0.6mol/mL的NaCl的溶液洗脱；流速均为1 mL/min，检测波长：220 nm；收集各峰组分，并对收集的各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑菌活性比较，取抑菌活性较好的离子交换层析峰组分冷冻干燥备用；d、Sephadex G‑25凝胶层析：取上述步骤c冷冻干燥的抑菌活性较好的离子交换层析峰组分溶解在超纯水中，浓度为0.1mg/mL；采用Sephadex G‑25凝胶层析柱经超纯水平衡后，进样量2mL，用超纯水进行洗脱；检测波长为220 nm，流速：0.5mL/min，80min后不再出峰，收集各峰组分，并对各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑制剂活性比较，取抑菌活性较好的凝胶层析峰组分冷冻干燥，即得产品紫菜蛋白抑菌肽。