6-(甲巯基)嘌呤的检测方法

摘要

本发明公开了6-(甲巯基)嘌呤(6-Methylmercaptopurine，6-MMP)的均相酶免疫检测方法和酶联免疫吸附剂检测方法以及上述两种检测方法包含的检测试剂。本发明的两种检测方法，用抗6-MMP特异性抗体研制的检测试剂能够确定待测样本中是否存在6-MMP，同样可以对6-MMP的含量进行定量测定。与传统的基因分型和HPLC方法相比，本发明提供的免疫检测方法具有操作简便、快速、检测结果准确、费用低等优势，对于将来进行临床大面积推广应用，特别是缺乏昂贵仪器的中小医院具有很好的前景。

主权项

1.一种6-(甲巯基)嘌呤(6-MMP)的均相酶免疫检测方法，使用6-(甲巯基)嘌呤的均相酶免疫检验试剂，该检测试剂由R1试剂和R2试剂组成，包括以下操作步骤： (1)采用全自动生化分析仪，将待测样本与6-(甲巯基)嘌呤检测试剂分别放入样本仓和试剂仓； (2)按照下表进行检测项目参数设置； (3)测定OD340nm的吸光值； (4)制作标准曲线来定量样本中的6-(甲巯基)嘌呤浓度； 其中： R1试剂的制备：将抗6-MMP特异性抗体稀释到均相R1缓冲液中，均相R1缓冲液含50mM Tris，0.25％BSA，50mM葡萄糖-6-磷酸和50mM烟碱腺嘌呤二核苷酸，所述6-MMP特异性抗体与R1缓冲液的体积比为1∶1000-1∶3000； R2试剂的制备：将酶-6MMP偶联物稀释到R2缓冲液中，R2缓冲液含100mM Tris和0.25％牛血清蛋白，所述酶-6MMP偶联物与R2缓冲液的体积比为1∶1000-1∶3000； 所述的酶-6MMP偶联物的制备如下： A.酶溶液制备：称取酶，其选自β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于磷酸缓冲液中，终浓度为2-6mg/mL； B.6-MMP衍生物的活化及偶联物的合成：用DMF溶解结构式(II)的6-MMP衍生物，使其终浓度为10-50mg/mL，通过三丁胺法进行活化，并与酶溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到6-MMP酶标偶联物； 所述抗6-MMP特异性抗体由6-MMP免疫原免疫动物后生产得到， 所述的6-MMP免疫原，其结构式如式(I)所示： 式(I) 式中，R为-(CH₂)₅-COO-，载体为牛血清蛋白， 所述6-MMP免疫原合成方法如下： (一)6-MMP衍生物的合成，其化学结构如式(II)所示： 式(II) 1)用30ml DMF溶解5.0g6-MMP和4.45g K₂CO₃，加入10ml含4.06g6-溴己酸乙脂的DMF溶液，在40℃条件下搅拌反应30min； 2)随后将反应后溶液用1N HCl溶液中和，并用乙酸乙酯萃取，有机相经干燥、过滤、真空干燥以及正相硅胶纯化，用25ml甲醇溶解1.5g纯化产物，随后加入含600mg LiOH.H₂O的水溶液，室温搅拌反应4小时，产物经浓缩后用水稀释、乙醚洗涤，水相溶液用1N HCl溶液调整pH至5.0，最后用二氯甲烷萃取，有机相经Na₂SO₄干燥、过滤和浓缩后得到白色固体状6-MMP衍生物； (二)6-MMP免疫原的合成 1)将200mg牛血清蛋白(BSA)溶解于50ml 0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中； 2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的6-MMP衍生物、3.5ml DMF、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg EDAC、50mg N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，Sulfo-NHS)，将其搅拌溶解，在室温下反应30min； 3)将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析纯化，得到6-MMP免疫原。