一种改进的DNA配基筛选方法

摘要

本发明涉及一种改进的DNA配基筛选方法。本发明采用随机合成的DNA文库，通过随机文库与特定蛋白孵育、PCR扩增和测序筛选可以与特定蛋白相结合的单链DNA链。在扩增与特定蛋白有亲和活性的配基时，将结合有特定蛋白和配基的琼脂糖载体作为模板直接加入到PCR体系中，进行扩增。该方法省略了将DNA配基从载体上洗脱和纯化的过程，简化了操作步骤，提高了扩增成功率。该方法可以用于蛋白配基、多肽配基以及化学小分子配基的筛选。

主权项

1.一种HIV-1p24蛋白特异性DNA配基筛选方法，其特征在于， 所述筛选方法具体为： 第一步：HIV-1p24蛋白与PharmaLink蛋白柱偶联，具体步骤如下： 考虑到HIV-1p24蛋白的耐受力，选择pH7.2的PBS作为缓冲液，所有的离心条件均为1000g，1min； （1）树脂柱上下颠倒，避免空气进入柱中，移除上下盖，柱子离心，去除保持缓冲液； （2）加入2ml pH7.2的PBS，coupling buffer，离心，重复2次； （3）加底盖，向柱中加入3mL HIV-1p24蛋白； （4）留取0.5ml蛋白样测定结合效率； （5）通风橱中加入40μL氰硼氢化钠溶液； （6）加上盖，室温震荡4小时； （7）去除上下盖，置于新的离心管中，离心，收集管中未结合的蛋白； （8）测定原始蛋白和未结合蛋白的浓度； （9）小心移除顶盖； （10）移除下盖，将柱放入新的管中，离心，去除coupling buffer； （11）用2mL Quenching Buffer洗柱，重复一次； （12）测得浓度为A₂₆₀=0.149,A₂₈₀=0.029； （13）加下盖，在通风橱中，在柱子中加入2mlQuenching Buffer和40μL氰硼氢化钠的混合液； （14）加上盖，上下颠倒，轻柔混匀30min； （15）小心移除顶盖； （16）移除底盖，将柱子置于新的管子中，离心，去除Quenching Buffer； （17）用2mL的洗涤液洗涤反应物以及未偶联的蛋白，离心，重复4次； （18）加入2mL的Storage Buffer平衡柱，离心，重复2次； （19）加底盖，从树脂柱子上方加入2mL的Storage Buffer； 加上盖，4℃保存； 第二步，合成并扩增随机DNA文库 （1）合成DNA配基文库，序列如下： 5’-ATCCGTCACACCTGCTCT-N₃₆-TGGTGTTGCTCCCGTAT-3’N=A,T,C,G； PCR扩增文库 反应体系如下：10×Buffer2.5μL，dNTPs4μL，primer F ATCCGTCACACCTGCTCT 0.75μL，primer R ATACGGGAGCAACACCA0.75μL,Taq HS DNA聚合酶0.5μL， MgCl₂4μL,加入5μL（1）中合成DNA配基文库，加灭菌的双蒸水至25μL,设置阴性对照； 反应条件：94℃预变性3min;循环参数94℃1min，53℃1min，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min；4℃保存； 第三步，Selex第一轮筛选 （1）将水浴锅预调到95℃； （2）将56nmol的步骤2中构建的随机DNA文库和1mL BB buffer的混合液在95℃加热5min，使DNA全部解为单链；BB buffer：0.5M NaCl,10mM Tris-HCl,1mMMgCl₂； （3）用2mL的BB buffer平衡步骤1中的蛋白柱，洗涤3次，1000g离心1min； （4）向平衡好的蛋白柱中加入步骤（4）中的单链模板，37℃孵育2h； （5）用2mL BB buffer清洗3次； 第四步，PCR扩增DNA配基 PCR扩增反应体系：10×Buffer2.5μL，dNTPs4μL，primer F ATCCGTCACACCTGCTCT 0.75μL，primer R-ATACGGGAGCAACACCA-0.75μL,Taq HS DNA聚合酶0.5μL，25mMMgCl₂4μL,加入5μL步骤3中连接有HIV-1p24蛋白和DNA配基的琼脂糖珠作为模板，加灭菌的双蒸水至25μL,设置一个阴性对照； 反应条件：94℃预变性3min；循环参数94℃1min，53℃1min，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min；4℃保存；将扩增产物作为下一轮筛选的文库； 第五步，重复步骤3和步骤4 8-15次，将DNA文库进行进一步筛选和富集； 第六步，PCR扩增产物连接到T载体并测序 以Selex技术筛选到的单链核酸产物为模板进行PCR扩增； 反应条件：94℃预变性3min；循环参数94℃1min，53℃1min， 72℃1min，1个循环；72℃延伸10min；4℃保存； PCR扩增反应体系：Taq Buffer8μL，dNTPs4μL，primer F ATCCGTCACACCTGCTCT0.75μL，primer R ATACGGGAGCAACACCA0.75μL,Taq HS DNA聚合酶0.5μL，加入5μL步骤5中连接有HIV-1p24蛋白和DNA配基的琼脂糖珠作为模板，加灭菌的双蒸水至25μL； 将T载体放在在冰上融化，然后将装有载体的离心管瞬时离心，使黏在管壁的液体沉于底部；连接反应体系为20μl：PCR扩增目的基因片段9μl，BufferI10μl，T-vector1μl；将该连接体系置16℃连接2h；反应结束后，将离心管置于冰上用于转化； 将感受态细胞Ecoli DH5α放在冰上解冻几分钟，取50μL于一新EP管中，向感受态细胞中加入1μL连接产物，轻轻地快速混匀，冰水浴30min，然后快速的再于42℃循环水中热击90s；快速将管移动到冰水浴中冷却2min；加入200μL无抗LB液体培养基，于摇床上37℃摇1h；取50μL用涂板，37℃倒置培养12-16h； 挑选分隔良好的克隆委托测序公司进行测序，然后将测序结果进行比对分析， 测序得到配基的序列如SEQ ID NO.1-10所示。