吲哚类钙离子荧光探针及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了结构式（I）所示吲哚素类钙离子指示剂，其中 R为H或甲基；R1至R7独立地选自H、卤素或甲基。本发明在发色团结构中增加了双键，共轭效应增大，激发波长红移，处于或接近可见光区，使用过程中减少了紫外光对细胞的损害，有利于观察和检测。

主权项

1.一种吲哚素类钙离子指示剂的制备方法，其特征在于采取以下步骤：（1）化合物1-(2-氯乙氧基)-4-甲基-2-硝基苯的合成，合成步骤如下： 在装有回流冷凝管，干燥管的100mL三口烧瓶中加入7.65g 4-甲基-2-硝基苯酚，40mL N, N-二甲基甲酰胺 ，待溶解完全后，搅拌下加入12.4mL 1-溴-2-氯乙烷，室温搅拌5分钟，加入10.35g K₂CO₃，升温至120℃反应2h，冷却至室温，加入70mL乙酸乙酯稀释，用3×50mL水洗涤，收集有机相，真空蒸除溶剂，抽滤，干燥；粗品用乙醇重结晶，产率96%，m.p. 33～34 oC ；（2）化合物4-甲基-2-(2-(4-甲基-2-硝基苯氧基)乙氧基)-1-硝基苯的合成，合成步骤如下：在装有机械搅拌器、回流冷凝管和温度计的三颈瓶中加入21.5g 1-(2-氯乙氧基)-4-甲基-2-硝基苯，18.4g 4-氯-5-甲基-2-硝基苯酚，100mL N, N-二甲基甲酰胺，搅拌使之溶解；向上述反应液中加入27.6g K₂CO₃；升温，使温度维持在140~160℃间，搅拌5~6h；待反应结束后，冷至室温，真空浓缩，将残渣分散于水中，抽滤收集形成的固体；粗品经乙醇-水重结晶提纯，产率93.8%，m.p. 148～150 oC；（3）化合物2-(2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基-5-甲基苯胺的合成，合成步骤如下：在装有回流冷凝管和搅拌器的250mL三颈瓶中，加入17g还原铁粉和20mL无水乙醇，搅拌下慢慢加入由1.04mL浓盐酸和5mL无水乙醇配成的溶液，小火加热煮沸20min；搅拌下，分批加入16.6g 4-甲基-2-(2-(4-甲基-2-硝基苯氧基)乙氧基)-1-硝基苯，之后加热回流2-4h；待反应完全后向热混合物中加入氢氧化钾溶液，趁热除去铁粉，并用热无水乙醇洗涤反应瓶和滤饼；合并滤液、洗液，加入6mol/L硫酸，析出硫酸盐，冷却，过滤，固体经空气干燥；将上述制得的硫酸盐溶于60℃热水中，但完全溶解后，冷至40℃，加入饱和氢氧化钠溶液使呈碱性，冷却，抽滤析出的固体；产率92.0%，m.p. 118～120 oC；（4）化合物4-甲基-4-甲基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N’, N’-四乙酸甲酯的合成，合成步骤如下：在装有回流冷凝管的250mL三颈瓶中，加入50mL热乙腈，搅拌下，加入13.20g 2-(2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙氧基-5-甲基苯胺，待完全溶解后，加入43.0mL  (iPr)₂NEt，23.5mL溴乙酸甲酯，将反应液回流24h后，再按1:2补加0.7mL溴乙酸甲酯和2.2mL(iPr)₂Net；待反应完成后，将反应液冷至40-60℃，倾入50mL乙酸乙酯中，抽滤、洗涤，合并滤液、洗液，真空除去溶剂，加入30mL甲醇，室温搅拌4-6h，抽滤析出的固体，产率77.8%，m.p. 93～95 oC；（5）类BAPTA化合物 BAPTA-CH₃-CHO的合成，合成步骤如下：在装有回流冷凝管、温度计的250mL三颈瓶中，加入50mL DMF，将此反应液冷至5~10℃，于40~45min内滴加9.6mL三氯氧磷，滴加完后，室温搅拌1~2h，反应液再冷至5~10℃，在小烧杯中称取11.2g  4-甲基-4-甲基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N’, N’-四乙酸甲酯，并加入50mL新蒸的DMF，搅拌使其全部溶解，于40~45min内滴加至上述反应液中，滴加完毕后，将反应混合物加热至40~45℃搅拌过夜；待反应完成后，冷至室温，倒入200g冰/水浴中，抽滤收集生成的固体，用水洗涤至pH=4~5，粗品重结晶得BAPTA-CH₃-CHO；产率72.5%，m.p. 108～110 oC；（6）类BAPTA化合物 BAPTA-Ole-CH₃-CHO的合成，合成步骤如下：在装有回流冷凝管和搅拌器的100mL三颈瓶中，加入11.5g类BAPTA化合物 BAPTA-CH₃-CHO与9.5g溴化乙醛缩乙二醇三苯基磷，并溶于50mL DMF中，搅拌下向上述混合液中分批加入1.2g，0.05mol NaH，保持温度90oC回流7h，降至室温，将反应液倾倒在100mL冰水中，搅拌至冰块完全溶化后用乙醚萃取混合物，合并有机层，再用50mL×3饱和食盐水萃取洗涤有机层至中性，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸出乙醚；向所剩油状物中加入50mLTHF和50mL10%HCl，室温下搅拌两小时后倾倒在100mL冰水中，搅拌至冰块完全溶化后用乙醚萃取混合物，合并有机层，再用50mL×3饱和食盐水萃取有机层至中性；有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸出乙醚；所得油状物用色谱柱分离，洗脱剂正己烷：乙酸乙酯为65:35；得到淡黄色粉末2.76g，产率20%；（7）Indo-Ole-M荧光指示剂甲酯的合成，合成步骤如下：将5 g类BAPTA化合物 BAPTA-Ole-CH₃-CHO, 4.24 g Witting试剂和15 g碳酸钾在 25mL DMF中混合，加热到90-95 °C；冷至室温搅拌过夜后倾入100mL冰水中搅拌至冰块融化；抽滤析出固体，并用乙酸乙酯、水萃取，合并有机相，蒸去溶剂，柱层析分离得到红色固体4.63 g，柱层析中甲苯:乙酸乙酯为3:1，产率68%；在氮气保护下将3 g上步所得固体与20mL 2mL亚磷酸三乙酯混合，反应升温至120-130 °C搅拌2-3 hr至反应结束，减压蒸去亚磷酸三乙酯，真空干燥残余物，柱层析分离得淡黄色粉末2.1g，柱层析中正己烷：乙酸乙酯为65:35梯度洗脱至65:50，产率73%。