HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特异性CTL的制备方法

摘要

本发明公开了HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特异性CTL的制备方法。该方法通过单采收集外周单个核细胞，富集、纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性MAGE抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，并用rhIL-2和rhIL-7联合促进T细胞生长；采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL；采用固相包被的抗人CD3单抗和IL-2刺激目标CTL的生长；加入γ射线辐照后的自体PBMC增强目标CTL的活化；加入rhIL-15培育扩增，收集鉴定。本方法制备的目标CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL_-CM，可用于肿瘤等免疫治疗。

主权项

HLA‑A0201限制性抗MAGE抗原特异性CTL的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤： a.CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化： 单采收集外周单个核细胞作为CTL前体细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从收集外周单个核细胞中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞； b.目标CTL诱导与第一轮扩增： 用负载HLA‐A0201限制性MAGE抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，同时加入rhIL‐2和rhIL‐7两种细胞因子联合促进T细胞生长；第二周再重复刺激一次，完成第一轮扩增； c.目标CTL纯化方法： 采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL，即选择Tetramer+CD8+T淋巴细胞； d.目标CTL第二轮扩增： 采用固相包被的anti‐human‐CD3mAb和IL‐2刺激目标CTL的生长；加入经γ射线辐照后的自体外周单个核细胞增强对目标CTL的活化；加入rhIL‐15继续培育，完成第二轮扩增，收集鉴定； 步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC是通过下列方法制备得到的：将外周单个核细胞贴壁后加入含rhGM‐CSF、rhIFNα、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获DC再加入目标抗原孵育即得； 各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为： a.目标CTL第一轮扩增每次加入量：rhIL‐2终浓度为500‐750IU/ml，rhIL‐7终浓度为50‐75ng/ml，DC与起始CD8+T细胞数量比为1:5； b.目标CTL第二轮扩增：rhIL‐2终浓度为200‐500IU/ml，rhIL‐15终浓度为100‐250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为1.0‐2.5μg/ml，γ射线辐照的外周单个核细胞与起始CTL数量比为2:1。